2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Культуральные_методы_диагностики_туберкулеза

Примеры приготовления питательных сред с препаратами

Стрептомицин

Для определения лекарственной чувствительности к стрептомицину используют стрептомицина сульфат. По данным производителя, активность стрептомицина сульфата составляет 750 мг в 1 г чистой субстанции.

Чтобы получить исходный рабочий раствор А, содержащий в 1 мл раствора 1 мг активной субстанции, следует приготовить навеску 20 мг стрептомицина сульфата с точностью до 0,2 мг, что будет соответствовать 15 мг активного начала, и растворить эту навеску в 15 мл стерильной дистиллированной воды – 1 мг/мл = 1000 мкг/мл.

Приготовление питательной среды. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (40 пробирок по 5 мл) необходимо в стерильную промаркированную колбу стерильной пипеткой налить последовательно: 2 мл раствора А + 198 мл среды = 10 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбу расчетное количество раствора А, а затем расчетное количество питательной среды, после чего тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Разлить содержимое колбы в 40 пробирок по 5 мл в каждую. Пробирки поместить в наклонном положении в аппарат для свертывания, добиваясь равномерной величины косяков (примерно 8–10 см), и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Изониазид

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции содержится 990 мг активного начала = 99%.

Приготовить навеску 20 мг изониазида. Далее приготовить растворы:

А: в 20 мл стерильной дистиллированной воды растворить 20 мг изониазида – 1 мг/ мл = 1000 мкг/мл;

Б: к 9 мл стерильной дистиллированной воды добавить 1 мл раствора А – 100 мкг/мл.

Приготовление питательной среды. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл х 40 пробирок) для каждого из двух разведений препарата необходимо в две стерильные промаркированные колбы (колба № 1 – 1 мкг/мл, колба

№2 – 10 мкг/мл) стерильной пипеткой налить последовательно:

в № 1 – 2 мл раствора Б + 198 мл среды = 1 мкг/мл;

в № 2 – 2 мл раствора А + 198 мл среды = 10 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбы расчетное количество раствора Б или А, а затем расчетное количество питательной среды. Содержимое каждой колбы необходимо тщательно перемешать круговыми движениями и разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы № 1. Пробирки поместить в наклонном положении в аппарат для свертывания, добиваясь равномерной величины косяков (примерно 8– 10 см), и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Рифампицин

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции – 970 мг активного начала = 97%.

Рифампицин нерастворим в дистиллированной в воде. Для приготовления раствора препарата рекомендуется использовать следующую последовательность приготовления растворов.

180 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Взвесить 30 мг порошковидной формы чистой субстанции рифампицина. Приготовленную навеску перенести в стерильную пробирку (1): 30 мг RIF + 2,0 мл этанола или диметилформамида – 14550 мкг/мл.

При использовании этанола: подогреть до t 35–40 °С на водяной бане.

Затем, используя стерильные пробирки, приготовить растворы:

А: 2,0 мл раствора (1) + 5,2 мл Н2О – 4000 мкг/мл;

Б: 2,5 мл раствора А + 2,5 мл Н2О – 2000 мкг/мл.

Для ускорения полного растворения препарата допустимо легкое подогревание на водяной бане до 35–40 оС.

Приготовление питательной среды. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (40 пробирок по 5 мл) необходимо в стерильную промаркированную колбу стерильной пипеткой налить последовательно: 4 мл раствора Б + 196 мл среды = 40 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбу расчетное количество раствора Б, а затем добавить в нее расчетное количество питательной среды. Содержимое колбы тщательно перемешать круговыми движениями, а затем разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую. Пробирки поместить в наклонном положении в аппарат для свертывания, добиваясь равномерной величины косяков (примерно 8–10 см), и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Этамбутол

Для определения лекарственной устойчивости используется этамбутол дигидрохлорид. Активность препарата: в 1 г чистой субстанции – 740 мг активного начала.

Приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества. Затем приготовить растворы:

А: растворить 20 мг этамбутола в 14,8 мл стерильной дистиллированной воды – 1 мг/мл = 1000 мкг/мл;

Б: к 8 мл стерильной дистиллированной воды добавить 2 мл раствора А – 200 мкг/мл.

Приготовление питательной среды. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл ×40 пробирок) на каждое разведение препарата необходимо в две стерильные промаркированные колбы (колба № 1 – 2 мкг/мл, колба № 2 – 5 мкг/мл) стерильной пипеткой налить последовательно:

в № 1 – 2 мл раствора Б + 198 мл среды = 2 мкг/мл;

в № 2 – 5 мл раствора Б + 195 мл среды = 5 мкг/мл.

Желательно вначале налить в обе колбы расчетное количество раствора Б, а затем последовательно добавить в каждую из них расчетное количество питательной среды. Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы. Затем содержимое каждой колбы разлить в 40 пробирок по 5 мл в каждую, начиная с колбы № 1. Пробирки поместить в аппарат для свертывания и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Канамицин

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции канамицина моносульфата колеблется от 750 до 823 мг активного начала. Для расчета возьмем величину активности, равную 750 мкг в 1 мг.

ЧтобыполучитьисходныйрабочийрастворА,содержащийв1млраствора2000 мкг активной субстанции, следует приготовить навеску 30 мг порошковидной формы канамицина моносульфата = 22,5 мг активного начала и растворить ее в 11,3 мл стерильной дистиллированной воды – 2 мг/мл = 2000 мкг/мл.

Приготовление питательной среды. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (40 пробирок по 5 мл) необходимо в стерильную промаркированную колбу стерильной пипеткой налить последовательно: 3 мл раствора А + 197 мл среды = 30 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбу расчетное количество раствора А, а затем добавить в нее расчетное количество питательной среды. Тщательно перемешать содержимое круговыми движениями колбы, а затем разлить его в 40 пробирок по 5 мл в каждую. Пробирки поместить в наклонном положении в аппарат для свертывания, добиваясь равномерной величины косяков (примерно 8–10 см), и проводить процедуру свертывания питательной среды в обычном порядке.

Протионамид (этионамид)

Оба препарата плохо растворяются в воде.

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции – 990 мг активного начала. Препарат нерастворим в дистиллированной воде, поэтому для приготовления рас-

твора А следует приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества и растворить ее в 3 мл ректифицированного этилового спирта 96° или диметил-сульфоксида, а затем добавить к раствору 6,9 мл стерильной дистиллированной воды – 2000 мкг/мл.

Приготовление питательной среды. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл ×40) необходимо в стерильную промаркированную колбу стерильной пипеткой налить последовательно: 3 мл раствора А + 197 мл среды = 30 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбу расчетное количество раствора А, а затем добавить в нее расчетное количество питательной среды. Перемешивание, разливание и коагулирование производят так же, как и в предыдущем случае.

Капреомицин

Содержание активного начала в препарате – 840 мг в 1 г.

Растворы капреомицина отличаются нестабильностью, поэтому их готовят непосредственно перед приготовлением сред.

Приготовить навеску 20 мг вещества. Затем приготовить раствор А:  20 мг капреомицина + 8,4 мл Н2О – 2000 мкг/мл.

Приготовление питательной среды. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл × 40) необходимо в стерильную промаркированную колбу стерильной пипеткой налить последовательно: 3 мл раствора А + 197 мл среды = 30 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбу расчетное количество раствора А, а затем расчетное количество питательной среды. Перемешивание, разливание и коагулирование производят так же, как с канамицином.

Циклосерин (D-cycloserin)

В 1 г препарата содержится 980 мг активного начала.

Растворы циклосерина отличаются нестабильностью, поэтому их готовят непосредственно перед приготовлением сред.

182 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Для приготовления раствора А следует приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества и растворить в 9,9 мл стерильной дистиллированной воды – 2 мг/мл = 2000 мкг/мл.

Приготовление питательной среды. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл × 40) необходимо в стерильную промаркированную колбу стерильной пипеткой налить последовательно: 3 мл раствора А + 197 мл среды = 30 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбу расчетное количество раствора А, а затем расчетное количество питательной среды. Перемешивание, разливание и коагулирование производят так же, как с канамицином.

ПАСК

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции – 877,2 мг активного начала. Для примера расчета возьмем среднюю величину активности, равную 880 мг в 1 г.

Чтобы получить исходный рабочий раствор А, содержащий в 1 мл раствора 1,0 мг активной субстанции, следует взвесить 20 мг порошковидной формы ПАСК = 17,6 мг активного начала и растворить навеску в 17,6 мл стерильной дистиллированной воды – 1 мг/мл = 1000 мкг/мл.

Затем готовят раствор Б: к 18 мл стерильной дистиллированной воды добавить 2 мл раствора А – 100 мкг/мл.

Приготовление питательной среды. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл ×40) необходимо в стерильную промаркированную колбу стерильной пипеткой налить последовательно: 2 мл раствора Б + 198 мл среды = 1 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбу расчетное количество раствора Б, а затем расчетное количество питательной среды. Перемешивание, разливание и коагулирование производят так же, как с канамицином.

Офлоксацин

Активность препарата: в 1 г чистой субстанции – 1000 мг активного начала. Офлоксацин нерастворим в дистиллированной воде, для его растворения при-

меняется 0,1N раствор NaOH. Для приготовления указанного раствора к навеске 0,4 г NaOH добавляют 100 мл стерильной дистиллированной воды = 0,1N раствор NaOH. Далее готовят растворы:

А: приготовить навеску препарата весом 20 мг вещества и растворить ее в 20 мл

0,1N раствора NaOH – 1 мг/мл = 1000 мкг/мл;

Б: к 12 мл стерильной дистиллированной воды добавить 3 мл раствора А –

200 мкг/мл.

Приготовление питательной среды. Для приготовления 200 мл питательной среды на 40 культур (5 мл ×40) необходимо в стерильную промаркированную колбу стерильной пипеткой налить последовательно: 2 мл раствора Б + 198 мл среды = 2 мкг/мл.

Желательно вначале налить в колбу расчетное количество раствора Б, а затем расчетное количество питательной среды. Перемешивание, разливание и коагулирование производят так же, как с канамицином.

Приложение 4

Видовая идентификация нетуберкулезных микобактерий

Все культуры, которые дали рост на среде Левенштейна–Йенсена с салициловым натрием или на среде с ПНБК, относятся к нетуберкулезным микобактериям и подлежат идентификации до вида.

Видовая идентификация НТМБ по степени сложности применяемых методик подразделяется на первичную и окончательную.

Первичная идентификация основана на морфологических и фенотипических свойствах МБ и проводится в базовых лабораториях ПТД. При осуществлении первичной идентификации своими силами бактериолог в наиболее короткий срок может установить принадлежность выделенной культуры к патогенным, потенциаль- но-патогенным, сапрофитным микобактериям или к группе родственных микроорганизмов. Знание видовой принадлежности микобактерий определяет дальнейшую тактику лечащего врача. Так, однократное выделение из диагностического материала потенциально-патогенных микобактерий требует повторного бактериологического обследования больного. Частые находки сапрофитных микобактерий, широко распространенных в природе, в материале от больных, особенно M. gordonae, могут указывать на контаминацию материала при взятии анализа, на загрязнение водопроводной или дистиллированной воды.

Окончательная идентификация основана на углубленном изучении биохимических свойств и культуральных потребностей МБ и осуществляется в лабораториях научных учреждений.

Первичная идентификация НТМБ

Первичная идентификация основана на таких признаках, как:

скорость роста;

способность образования пигмента;

способность роста при различных температурах.

Для выявления этих признаков не требуется специального оборудования и реактивов, поэтому их можно изучать в бактериологических лабораториях ПТД. Рекомендуется иметь дополнительный термостат с температурой 45 °С.

Скорость роста

Скорость роста микобактерий – это время, необходимое для формирования видимых, зрелых колоний на плотной среде.

МБ, которые формируют такие колонии в течение 7 дней, называются быстрорас­ тущими. К группе быстрорастущих МБ относятся М. fortuitum и M. chelonae, для полного роста которых требуется не более 5 дней. Однако при выделении из патологического материала быстрорастущие МБ могут иметь более продолжительный период роста.

МБ, которым для формирования колоний необходим более длительный период времени, называются медленнорастущими. К ним относятся M. avium, M. kansasii,

184 Культуральные методы диагностики туберкулеза

M. xenopi и др. В то же время избыток посевного материала может быть причиной быстрого появления роста медленнорастущих МБ. Кроме того, учет скорости роста необходимо проводить по времени образования сформированных колоний, а не по появлению инициального роста.

Скорость роста МБ оценивают по скорости роста субкультуры.

Методика выполнения

0,1 мл суспензии исследуемой культуры в стандартном разведении засевают на среду Левенштейна–Йенсена, инкубируют при температуре 37 °С. Наблюдение за культурой первые 5–7 дней ежедневное, далее – еженедельно, до момента появления сформированных колоний.

За скоростью роста культуры можно наблюдать при определении лекарственной чувствительности микобактерий. Читать результаты лекарственной чувствительности быстрорастущих микобактерий можно через 5–7 дней, медленнорастущих – через 21 день.

Рост микобактерий при разных температурах. Определение способности роста при разных температурах

Методика выполнения

1.Приготовить суспензию исследуемой культуры в физиологическом растворе по стандарту мутности № 5.

2.Развести в десять раз (0,5 мл суспензии прибавить к 4,5 мл физиологического раствора).

3.Засеять по 0,2 мл суспензии на 4 пробирки со средой Левенштейна–Йенсена.

4.Инкубировать засеянные пробирки при 22 (комнатная температура), 28, 37 и 45 °С.

Почти все виды НТМБ хорошо растут при 22 °С. При температуре 45 °С растут 86% культур М. avium и все культуры М. xenopi.

Способность продуцировать пигмент

Колонии НТМБ могут иметь как кремовую, так и интенсивную желто-оранжевую окраску. В зависимости от окраски колоний и способности образования пигмента под действием света нетуберкулезные микобактерии делятся на 3 группы.

1.Фотохромогенные МБ. Продуцируют желтый пигмент только под действием света, в темноте они имеют кремовый цвет. Типичным представителем этой группы является М. kansasii.

2.Скотохромогенные МБ. Продуцируют пигмент от интенсивно-желтого до оранжевого цвета при росте как на свету, так и в темноте. К ним относятся М. gordonae

и М. xenopi.

3.Нехромогенные МБ. Не образуют пигмент, их колонии имеют только беловатые или кремовые оттенки. В эту группу входят М. avium, M. malmoens, M. terrae complex и др. Среди них встречаются культуры, которые изменяют окраску в процессе старения или при неблагоприятных условиях роста (22 °С).

Так, если быстрорастущая МБ показала деградацию салицилового натрия, то это может быть M. fortuitum или M. chelonae.

Следует определить наличие нитратредуктазы: положительная реакция у

M. fortuitum, отрицательная – у M. chelonae.

Медленнорастущая нехромогенная МБ – M. avium (наиболее частый возбудитель микобактериоза) и M. terrae complex (сапрофитные МБ).

Следует определить способность роста выделенной МБ при различных температурах: при температуре 45 °С растут M. avium и не растут представители M. terrae complex.

Таким образом, на основании знания нескольких свойств микобактерий можно провести первичную идентификацию. Для окончательной идентификации выделенные культуры направляют в лаборатории научно-исследовательских институтов.

Окончательная идентификация

Окончательная идентификация с применением сложных биохимических исследований проводится в специализированных лабораториях. Идентификация проводится на основании определения активности ферментов (амидазы, арилсульфатаза, каталаза), толерантности к различным химическим агентам, способности к гидролизу Твина 80, восстановлению нитратов и теллурита калия, усвоению железа, росту на среде с хлористым натрием.

Результаты первоначальных исследований МБ позволяют выбрать биохимические тесты, необходимые для окончательной идентификации НТМБ (схемы 1, 2, 3, 4).

Схема 1

Непигментированные медленнорастущие микобактерии

Экспозиция на свету

Схема 2

Скотохромогенные медленнорастущие микобактерии (желтые или оранжевые)

Восстановление нитратов

Схема 3

Непигментированные быстрорастущие микобактерии Трехдневная арилсульфатаза

188 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Биохимический профиль и морфологические свойства испытуемого штамма следует сопоставить с данными таблицы 2, чтобы определить вид МБ.

Т а б л и ц а 2

Характеристика наиболее часто встречающихся в клиническом материале видов нетуберкулезных микобактерий

Примечание. М – медленнорастущие, Б – быстрорастущие, Н – нехромогенные, С – скотохромогенные, Ф – фотохромогенные, В – варьирует.

Биохимические методы идентификации микобактерий

Каталаза – внутриклеточный фермент, способный расщеплять перекись водорода на воду и кислород. Наличие фермента определяется путем добавления перекиси водорода в исследуемую культуру МБ и наблюдения за образованием пузырьков кислорода. Фактически все МБ, за исключением М. gastri, изониазид-устойчивых МБТ, М. bovis и некоторых непатогенных штаммов М. kansasii, имеют этот фермент. Виды каталазопродуцирующих МБ различаются по степени каталазной активности, которую определяют у интактных клеток полуколичественным методом, и по термостабильности фермента, которую определяют при нагревании культуры до 68 °С.