2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Культуральные_методы_диагностики_туберкулеза

бирки со средой, как при обычном посеве. Определение нитратредуктазы проводят на 8–12-й день с момента посева. Для этого используют 7,5% раствор реактива Грисса.

В одну из контрольных пробирок от каждой выделенной культуры закапывают с помощью медицинской капельницы 2–3 капли 7,5% раствора Грисса. При появлении в контрольной пробирке в течение последующих 1–3 минут красного или ржа- во-красного окрашивания поверхности среды и конденсата, а также изменении цвета реактива от слабо-красного (розоватого) до ржаво-красного реактив Грисса закапывают в опытные пробирки. Учет результата проводится по окрашиванию поверхности среды и конденсата в пробирках. Изменение окраски среды и реактива может варьировать от малинового до бурого.

При отрицательной реакции реактив Грисса не меняет цвет, а поверхность среды приобретает ярко-синий цвет или слабо-фиолетовое окрашивание, либо не меняет окраски.

Метод может применяться в комбинации с ТСН и салициловокислым натрием. Он также используется для тестирования роста микобактерий туберкулеза на среде с противотуберкулезными препаратами при исследовании лекарственной чувствительности.

Метод восстановления нитратов по Tsukamura

Метод используется для дифференциации МТБ, M. bovis и некоторых видов НТМБ, которые обладают морфологически сходными колониями, одинаковой скоростью роста и способностью к пигментообразованию. МБТ, M. kansasii, M. szulgai и М. fortuitum имеют положительную реакцию, M. bovis и M. chelonae – отрицательную.

Реактивы

1.Культура, выращенная на плотной питательной среде в течение 3–4 нед.

2.Для приготовления М/15 фосфатного буфера рН 7,1 готовят:

а) М/15 раствор однозамещенного фосфорнокислого калия (9,078 г КН2РО4 на 1 л дистиллированной воды);

б) М/15 раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия (11,876 г Na2HPО4 на 1 л дистиллированной воды).

Для получения 100 мл фосфатного буфера рН 7,1 берут 33,4 мл раствора «а» и 66,6 мл раствора «б».

3.Готовят 0,1% раствор нитрата натрия в фосфатном буфере. Навеску в 100 мг

NaNО3 растворяют в 100 мл фосфатного буфера, стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120 °С, хранят в холодильнике. Перед постановкой реакции нагревают до комнатной температуры.

4.Готовят реактив Эрлиха: 2 г парадиметиламинобензальдегида на 100 мл 10% раствора соляной кислоты.

Методика выполнения

10 мг влажной массы испытуемой культуры со среды Левенштейна–Йенсена вносят в пробирку с 1 мл 0,1% раствора нитрата натрия в фосфатном буфере. Инкубируют при 37 °С в течение 24 ч. Добавляют 2 капли реактива Эрлиха и 0,5 мл 10% раствора соляной кислоты. Окрашивание раствора в желтый цвет свидетельствует о восстановлении нитратов – положительный тест.

Для внутрилабораторного контроля в качестве положительного контроля следует использовать штамм M. tuberculosis, в качестве отрицательного – M. bovis или

M. avium.

Результат выражается в крестах от + до ++++ в сравнении с контролем.

На получение правильного результата влияет возраст исследуемой культуры (3– 4 нед.) и ее количество. В случае получения отрицательного результата рекомендуется повторить тест.

Модификация теста восстановления нитратов по Tsukamura

В контрольную пробирку с хорошим ростом культуры после определения ее лекарственной устойчивости вносят 1 мл 0,1% раствора нитрата натрия в фосфатном буфере. Инкубируют при 37 °С в течение 24 ч. В пробирку с реагирующей смесью добавляют 2 капли реактива Эрлиха и 0,5 мл 10% раствора соляной кислоты. Преимущество модифицированного метода заключается в использовании «свежей» культуры в достаточном количестве.

Метод восстановления нитратов по Virtanen

Реактивы

1.Культура, выращенная на среде Левенштейна–Йенсена в течение 3–4 недель.

2.Раствор нитрата натрия – 0,01М раствор NaNO3 в 0,45М фосфатном буфере (рН 7,0). Для приготовления раствора взять:

–навеску нитрата натрия (NaNO3) – 0,085 г;

–навеску однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4) – 0,117 г;

–навеску двузамещенного фосфорнокислого натрия (Na2HPO4) × 12H2O – 0,485 г.

Растворить приготовленные навески в 100 мл дистиллированной воды.

3.Реагент № 1 – 50% соляная кислота (HCl) (к 10 мл дистиллированной воды прибавить 10 мл концентрированной соляной кислоты).

4.Реагент № 2 – 0,2% раствор сульфаниламида (0,2 г растворить в 100 мл дистиллированной воды).

5.Реагент № 3 – 0,1% водный раствор N-нафтил-этилендиамингидрохлорида (0,1 г растворить в 100 мл дистиллированной воды, хранить в холодильнике)

6.Стерильные пробирки и пипетки.

Методика выполнения

1.10 мг влажной массы испытуемой культуры со среды Левенштейна–Йенсена вносят в пробирку (13×100 мл), содержащую 2 мл раствора нитрата натрия в фосфатном буфере.

2.Поместить пробирку с культурой в водяную баню при температуре 37 °С на 2 часа. Образование нитритов определяется реактивом Грисса (см. выше).

3.В каждую пробирку с исследуемой культурой добавить: pеагент № 1 – 1 капля;

pеагент № 2 – 2 капли; pеагент № 3 – 2 капли.

После прибавления реагентов незамедлительно смотрят на появление красного окрашивания.

4.Результат выражается в крестах от + до ++++ по сравнению с контролем.

112 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Для внутрилабораторного контроля в качестве положительного контроля следует использовать штамм M. tuberculosis, в качестве отрицательного – M. bovis или

M. avium.

Определение ниацина (ниациновый тест)

Все микобактерии продуцируют ниацин (никотиновую кислоту). Большинство видов микобактерий содержат фермент, который превращает ниацин в никотинамид аденин динуклеид. M. tuberculosis блокирует этот фермент, и ниацин аккумулируется в культуре и в среде, на которой они растут, в большом количестве.

Реакция основана на том, что никотин вступает в реакцию с цианистым бромидом и анилином и дает желтое окрашивание.

Реактивы

1.3–4 недельная культура микобактерий на среде Левенштейна–Йенсена не менее

50–100 колоний.

2.Диагностические полоски DIFCO – ниациновые полоски.

3.Стерильный физиологический раствор.

4.Стерильные пипетки и пробирки с пробками.

Методика выполнения

1.В пробирку с культурой МБ на среде Левенштейна–Йенсена налить 3 мл стерильной дистиллированной воды или физиологического раствора (0,85% раствор NaCl). Пользуясь пипеткой, осторожно соскоблить поверхностный рост культуры, чтобы сделать более доступной экстракцию ниацина.

2.Наклонить пробирку так, чтобы поверхность среды была в горизонтальном положении и вся покрывалась жидкостью. В таком положении оставить при комнатной температуре на 30 мин.

3.Осторожно стерильной пипеткой отобрать 0,6 мл полученного экстракта и перенести в стерильную пробирку 13×100 мм.

4.Используя обожженный над пламенем пинцет, поместить индикаторную ниациновую полоску в 0,6 мл экстракта (в опытные пробирки, положительный и отрицательный контроль). Плотно закрыть пробку. Интенсивно встряхнуть пробирки, чтобы смешать жидкость с реагентом на конце полоски. Оставить пробирки при комнатной температуре.

5.Время экспозиции 12–15 минут (не более 30). Появление желтого окрашивания раствора указывает на положительный ниациновый тест.

6.После окончания теста пробирки автоклавируют.

Необходимо помнить, что ряд нетуберкулезных микобактерий – M. simiae, M. chelonae и некоторые штаммы M. marinum также блокируют ниацин. Хромогенные штаммы НТМБ могут давать ложно-положительные реакции.

Отрицательный результат не является окончательным, так как культуры МБТ, выделенные от больных длительно получавших ПТП, слабо продуцируют ниацин. В подобных случаях необходимо повторить тест. Культуру пересеять, чтобы получить пышный рост и использовать для тестирования 5–6-недельную культуру.

Для внутрилабораторного контроля в качестве положительного контроля следует использовать штамм M. tuberculosis, в качестве отрицательного – M. bovis.

Определение ниацина с применением барбитуровой кислоты

Реактивы

1.0,1N раствор едкого натра. Навеску 0,45 г растворить в 100 дистиллированной воды.

2.0,5N раствор соляной кислоты. 2,1 мл концентрированной соляной кислоты аккуратно добавляем к 50 мл дистиллированной воды.

3.5% раствор барбитуровой кислоты. Навеску 2,5 г барбитуровой кислоты растворяем при нагревании в смеси, состоящей из 25 мл ДМСО (диметилсульфаксид), 12,5 мл спирта и 12,5 мл дистиллированной воды.

4.5% раствор роданистого аммония. Навеску 5 г роданистого аммония растворить в 100 мл дистиллированной воды.

5.5% раствор хлорамина. Навеску 5 г хлорамина растворить в 100 мл дистиллированной воды.

Методика выполнения

1.Культура микобактерий на среде Левенштейна–Йенсена, возраст 4–5 недель. В пробирку с культурой налить 2 мл стерильной дистиллированной воды. Пробирки переместить в наклонное положение так, чтобы вода покрывала всю поверхность с выросшей культурой.

Инкубировать при температуре 37 °С в течение 20–24 час.

2.На следующий день отсасывают пипеткой по 1 мл экстракта ниацина в пробир-

ки 13×100 мм.

3.В каждую пробирку закапывают приготовленные реактивы в строго установленном порядке:

а) раствор соляной кислоты – 1 капля; б) раствор роданистого аммония – 1 капля; в) раствор хлорамина – 8 капель (0,5 мл);

г) раствор едкого натра – 5 капель (0,2 мл); д) раствор барбитуровой кислоты – 5 капель (0,2 мл).

4.Пробирки с экстрактом ниацина и реагентами подогреваем на водяной бане 60 °С в течение 2–5 мин. Наблюдаем появление розового окрашивания жидкости – положительный результат у МБТ.

Для внутрилабораторного контроля в качестве положительного контроля следует использовать штамм M. tuberculosis, в качестве отрицательного – M. bovis.

Определение потребности в кислороде

Известно, что M. bovis относится к микроаэрофилам. Уменьшенная потребность в кислороде проявляется при росте на полужидкой среде Лебека. МБТ дают на этой среде поверхностный пленочный рост, а M. bovis растут, отступив на 1 см вглубь от поверхности среды в виде беловатого облачка.

Среда ЛЕБЕКА

Реактивы

1.Приготовить навески:

–L-аспарагин – 0,4 г

–Двузамещенный фосфорнокислый калий (К2НРО4) – 0,05 г

114 Культуральные методы диагностики туберкулеза

–Лимонная кислота – 0,2 г

–Магний сернокислый (MgSO4 × 6H2O) – 0,05 г

–Аммоний лимоннокислый – 0,005 г

–Глицерин – 6,0 мл

2.Растворить приготовленные реактивы в 80 мл дистиллированной воды, нагревая для улучшения растворения. Прибавить глицерин и установить (с помощью едкого натра и индикаторной бумажки) рН 7,2.

3.Добавить 2 г простого агара (агар-агар), для растворения агара в течение 1 часа прогревать содержимое колбы на водяной бане, многократно взбалтывая.

4.Стерилизовать при 1 атмосфере в течение 30 мин, охладить раствор до

50 °С.

5.В пробирки разлить по 0,5 мл инактивированной сыворотки крупного рогатого скота и подогреть на водяной бане до 50 °С. Вместо бычьей сыворотки можно использовать сыворотку человека, кролика и морской свинки.

6.В пробирки с сывороткой добавить по 4 мл среды при температуре 50 °С. Легким покачиванием пробирок перемешать сыворотку со средой. Среда должна быть прозрачной.

Методика выполнения

По 0,2 мл исследуемой культуры в стандартном разведении засевают на приготовленную среду. Инкубировать в термостате при температуре 37 °С в течение 3–4 недель.

Для контроля качества использовать M. tuberculosis H37Rv и M. bovis.

При просмотре выросших культур определяем характер роста и расположение его в пробирке. МБТ дают поверхностный рост. M. bovis растут в глубине среды на 1 см от ее поверхности в виде белого облачка.

Определение способности роста культуры на среде с гидразид тиофен-2-карбоксиловой кислотой (ТСН)

Метод используется для дифференциальной диагностики микобактерий туберкулезного комплекса. M. tuberculosis резистентны к ТСН и дают хороший рост на этой среде. M. bovis и M. bovis-BCG чувствительны к ТСН и не растут на среде, содержащей это соединение.

Реактивы

1.Среда Левенштейна-Йенсена 600мл (до свертывания).

2.Гидразид тиофен-2-карбоксиловой кислоты.

3.Приготовить навеску ТСН 20 мг, растворить в 20 мл стерильной дистиллированной воды. Получили разведение 1000 мкг/мл. Раствор А.

4.К 12 мл стерильной дистиллированной воды прибавить 3 мл раствора А. Получили разведение 200 мкг/мл. Раствор Б.

5.Приготовление среды Левенштейна–Йенсена с ТСН:

а) разведение – 199 мл среды + 1 мл раствора Б – разведение 1 мкг/мл; б) разведение – 195 мл среды + 5 мл раствора Б – разведение 5 мкг/мл; в) контрольная пробирка со средой без реактива.

6.Опытные и контрольную среды разлить в пробирки по 5 мл, стерилизовать при температуре 85 °С в течение 45 мин.

Методика выполнения

По 0,2 мл исследуемой культуры в стандартном разведении засевается на поверхность среды. Инкубация при температуре 37 °С. Просмотр роста культур через 3– 4 недели. Определение чувствительности микобактерий к ТСН проводится одновременно с определением их лекарственной устойчивости.

Метод используется для дифференциации микобактерий туберкулезного комплекса. М. tuberculosis устойчивы ко всем концентрациям ТСН, M. bovis чувствительны к ТСН в концентрации 1 и 5 мкг/мл (следует помнить, что M. bovis иногда дает слабый рост на среде с концентрацией 1,0 мкг/мл, но никогда не растет на среде с 5 мкг/мл). M. bovis-BCG чувствителен ко всем испытуемым концентрациям.

Определение способности роста культуры на среде с никотинамидом

M.tuberculosis чувствительны к никотинамиду. M. bovis и вакцинный штамм M. bovis-BCG обладают естественной резистентностью к никотинамиду. На этом свойстве основана дифференциация туберкулезного комплекса.

Реактивы

1.Среда Левенштейна–Йенсена (до свертывания).

2.Никотинамид.

3.Приготовление основного раствора никотинамида:

навеску никотинамида 1000 мг растворить в 10 мл стерильной дистиллированной воды; стерилизовать через бактериальный фильтр или кипячением на водяной бане при 100 °С в течение 30 мин.

4.Приготовление рабочего раствора:

Раствор А – к 4 мл дистиллированной воды прибавить 1 мл основного раствора. Разведение 20 мг/мл.

Раствор Б – к 3 мл дистиллированной воды прибавить 2 мл основного раствора. Разведение 40 мг/мл.

5.Приготовление среды с никотинамидом:

а) к 95 мл среды Левенштейна–Йенсена прибавить 5 мл рабочего раствора А; конечная концентрация – 1 мг/мл;

б) к 95 мл среды Левенштейна–Йенсена прибавить 5 мл рабочего раствора Б; конечная концентрация – 2 мг/ мл;

в) одновременно приготовить 100 мл контрольной среды Левенштейна–Йенсена. Опытные и контрольную среды разлить в пробирки по 5 мл, стерилизовать при

температуре 85 °С в течение 45 мин.

По 0,2 мл исследуемой культуры в стандартном разведении засевается на приготовленные среды, инкубация при температуре 37 °С в течение 3 недель.

Определение чувствительности к циклосерину

У всех штаммов M. bovis-BCG отмечается устойчивость к 30–50 мкг/мл циклосерина. Эта биологическая особенность вакцинного штамма BCG является важным диагностическим тестом в его идентификации.

Реактивы

1.Среда Левенштейна–Йенсена 200 мл (до свертывания).

2.Циклосерин.

116 Культуральные методы диагностики туберкулеза

3.Навеску циклосерина 20 мг растворить в 5 мл дистиллированной воды, разведение 4000 мкг/мл.

4.К 99 мл среды Левенштейна–Йенсена прибавить 1 мл приготовленного раствора. Конечная концентрация препарата – 40 мкг/мл.

5.Одновременно приготовить 100 мл контрольной среды.

6.Опытную и контрольную среды разлить в пробирки по 5 мл, стерилизовать при температуре 85 °С в течение 45 мин.

По 0,2 мл исследуемой культуры в стандартном разведении засевается на приготовленные среды, инкубация при температуре 37 °С в течение 3 недель.

M. tuberculosis и M. bovis чувствительны к циклосерину, вакцинный штамм BCG дает рост на среде с циклосерином.

В таблице 5 представлено 7 методов, позволяющих дифференцировать M. tuberculosis и M. bovis. Это не означает, что все вышеперечисленные тесты должны использоваться в лаборатории одновременно. С другой стороны, нельзя останавливать свой выбор на применении только одного из дифференциально-диагности- ческих тестов, так как ни один тест не имеет 100% чувствительность и специфичность. Только сочетание нескольких тестов позволяет провести четкую идентификацию микобактерий.

Примечание. S – чувствительный штамм, R – устойчивый штамм, V – варьирует результат.

Впрактических лабораториях для идентификации M. tuberculosis широкое применение получили определение способности роста МБ на среде с ТСН и определение активности нитратредуктазы. Можно также использовать в комплексе определение нитратредуктазы и ниациновый тест.

Втех случаях, когда идентификация не прошла (один из тестов положительный, другой – отрицательный), следует пересеять культуру, дождаться получения пышного роста и поставить оба теста заново. Для получения правильного результата идентификации можно добавить еще один (третий из вышеперечисленных) тест.

Ввиду появления случаев БЦЖ-осложнений у детей необходимо проводить дифференциальную диагностику между M. tuberculosis и M. bovis-BCG. С этой целью рекомендуется использовать три теста: определение нитратредуктазы, ниацина и способность к росту на среде с никотинамидом или циклосерином. Культуры M. bovisBCG не имеют ниацина, не восстанавливают нитраты и дают рост на этих средах.

Культуры, не поддающиеся идентификации в условиях лаборатории противотуберкулезного диспансера, рекомендуется направлять в бактериологические региональные референс-лаборатории для проведения углубленной идентификации.

2.6.4. Внутрилабораторный контроль качества предварительной идентификации и определения вида микобактерий

Для обеспечения качества исследований необходимо регулярно контролировать качество и годность реактивов и оборудования, правильность регистрации результатов.

Для внутрилабораторного контроля качества проводимых процедур одновременно с диагностическими пробами необходимо тестировать контрольные культуры

M. tuberculosis H37Rv, M. bovis и M. fortuitum или M. gordonae. В связи с этим необходи-

мо вести музей этих культур.

Следует обратить внимание на то, что M. fortuitum, так же, как и M. tuberculosis, дает положительную нитратредуктазную реакцию.

Результаты внутрилабораторного контроля качества исследований должны регистрироваться в специальном журнале или в журнале регистрации исследований на лекарственную чувствительность и видовую идентификацию.

118 Культуральные методы диагностики туберкулеза

2.7. Исследование лекарственной чувствительности микобактерий

2.7.1. Основные понятия

Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза (ЛУ МБТ) является одной из самых серьезных проблем современной фтизиатрии. Определение лекарственной чувствительности (ЛЧ) микобактерий является решающим фактором для выбора оптимальной химиотерапии туберкулеза, прогноза и своевременной коррекции лечения, а также служит важным показателем эпидемиологической напряженности по туберкулезу в отдельных регионах или даже в масштабах страны.

Чувствительность микобактерий к противотуберкулезным препаратам – это неспособность бактериальных клеток штамма расти на питательной среде с минимальной ингибирующей концентрацией препарата, задерживающей рост микобактерий при стандартных условиях постановки опыта. Чувствительными к данному препарату считаются те штаммы микобактерий, на которые этот препарат в критической

концентрации оказывает бактерицидное или бактериостатическое действие.

Устойчивость (резистентность) определяется как снижение чувствительности до такой степени, что данный штамм микобактерий способен размножаться при воздействии на него препарата в критической или более высокой концентрации. Уровень (или степень) устойчивости данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией препарата (мкг/мл), при которой еще наблюдается размножение микобактерий.

Критическая концентрация – это концентрация препарата, подавляющая рост возбудителя дикого типа, но не устойчивых мутированных штаммов.

Для различных противотуберкулезных препаратов установлена определенная критическая концентрация. Она отличается от минимальной ингибирующей концентрации и имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на МБТ в условиях макроорганизма и выбрана с учетом фармакокинетических и фармакодинамических свойств ПТП.

Для разных по составу питательных сред критическая концентрация одного и того же препарата различна. Значения критических концентраций ПТП существенно отличаются при использовании разных методов определения ЛЧ МБТ.

Большое значение для принятия конкретных решений о проведении терапии больного туберкулезом имеет структура лекарственной резистентности МБТ.

В соответствии с международными стандартами различают следующие категории ЛУ МБТ.

Монорезистентность – устойчивость только к одному (любому) противотуберкулезному препарату.

Полирезистентность – устойчивость к двум и более противотуберкулезным препаратам, исключая резистентность одновременно к изониазиду и рифампицину.

Множественная лекарственная устойчивость, или мультирезистентность

(МЛУ, или MDR от англ. Multy Drug Resistance), – это особая категория среди полирезистентных штаммов, у которых имеется устойчивость по меньшей мере к изониазиду и рифампицину одновременно, независимо от резистентности к другим препаратам.

Лечение больных с МЛЧ МБТ представляет особенные трудности, так как изониазид и рифампицин остаются до настоящего времени наиболее эффективными ПТП, а устойчивость к ним сопровождается, как правило, резистентностью к стрептомицину, а также нередко и к другим противотуберкулезным препаратам.

Чрезвычайная лекарственная устойчивость. В 2006 году в международной клас-

сификации появилось понятие чрезвычайной лекарственной устойчивости (XDR), которая определяется как устойчивость, по крайней мере, к изониазиду, рифампицину, фторхинолонам и к одному из трех инъекционных препаратов (капреомицину, канамицину или амикацину).

Для оценки эпидситуации в международной практике принято различать лекарственную устойчивость микобактерий у ранее не леченных (первичную) и ранее леченных больных (приобретенную).

Лекарственная устойчивость микобактерий у ранее не леченных больных определяется как устойчивость, обнаруженная у микобактерий, выделенных от пациента, никогда не лечившегося

от туберкулеза или получавшего лечение менее одного месяца.

В данном случае подразумевается, что больной заразился лекарственно-устойчи- вым штаммом микобактерий. Первичная лекарственная устойчивость характеризует состояние микобактериальной популяции, циркулирующей в данной территории, и

еепоказатели важны для оценки степени напряженности эпидемической ситуации. ЛУ микобактерий у ранее не леченных больных имеет большое клиническое и

эпидемиологическое значение, поэтому для правильной ее оценки чрезвычайно важно исследовать культуру, выделенную из диагностического материала, собранного до начала лечения.

Частота лекарственной устойчивости у ранее не леченных больных рассчиты-

вается как отношение количества впервые выявленных больных туберкулезом с резистентными МБТ ко всем обследованным впервые выявленным бациллярным больным за определенный период (как правило, календарный год).

Лекарственная устойчивость микобактерий у ранее леченных больных определяется как устойчивость, выявленная у больного туберкулезом, получавшего лечение в течение одного месяца и более.

Развитие приобретенной ЛУ у больного с впервые выявленным туберкулезом является обычно результатом неэффективного лечения. Приобретенная ЛУ МБТ у хро-

120 Культуральные методы диагностики туберкулеза