2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Культуральные_методы_диагностики_туберкулеза

3.1. Автоматические и полуавтоматические анализаторы

Необходимость внедрения новых методов современной и качественной культуральной диагностики туберкулеза очевидна, поскольку использование традиционных методик не всегда позволяет получить своевременные, информативные и надежные результаты.

Основным недостатком классического метода выделения микобактерий на плотных средах является его продолжительность. Сокращение сроков культивирования микобактерий с сохранением или увеличением чувствительности и специфичности метода является основным направлением развития культуральной диагностики туберкулеза.

К настоящему времени микобактериологическая лаборатория прошла несколько этапов по пути сокращения сроков культуральной диагностики туберкулеза, начиная с практического использования в 80-х годах прошлого столетия принципиально нового радиометрического метода выявления роста и определения лекарственной чувствительности микобактерий с помощью системы ВАСТЕС 460, разработанной компанией Becton Dickinson (BD).

Известно, что жидкие среды, или бульоны, обеспечивают более быстрое получение результата по сравнению с плотными. Фаза логарифмического роста популяции микобактерий достигается уже к 5–10-му дню после инокуляции в бульон материала от больного туберкулезом. В то же время применение жидких сред осложняется трудоемким процессом собственно детекции размножения микобактерий, а также высоким уровнем их контаминации другими микроорганизмами.

Эволюция методов культивирования микобактерий в жидких средах происходила в направлении разработки относительно дешевого и технически доступного метода быстрой детекции, осуществимого с наибольшей степенью биозащиты персонала.

В1977 г. G. Middlebrook описал способ радиометрической детекции роста микобактерий в селективной жидкой среде, что положило начало созданию наиболее распространенных и комерчески доступных систем бульонного культивирования: BACTEC 460 (BD), BBL Septi-Chek AFB (BD), BBL MGIT (BD), BACTEC MGIT 960 (BD), MB/BacT (Organon Teknika) и ВасТ/Аlert 3D (BioMerioux).

Полуавтоматическая система BACTEC 460 (рис. 39) для выращивания и идентификации микобактерий использует жидкую среду Middlebrook 7Н12. Рост микобак-

терий в ней определяется путем регистрации уровня меченого СО2, который образуется в процессе микробной утилизации субстрата с пальмитиновой кислотой, содержащей радиоактивный 14С. Внедрение BACTEC 460 позволило сократить сроки выявления возбудителя туберкулеза до 14 дней, а также проводить быструю идентификацию комплекса M. tuberculosis и определять лекарственную чувствительность микобактерий.

Виндустриально развитых странах система BACTEC 460 получила широкое распространение и стала своеобразным референс-методом для вновь создаваемых систем бульонного культивирования. Золотым диагностическим стандартом для прак-

Рис. 39 Первая полуавтоматическая система BACTEC 460

тических лабораторий является сочетание подобной системы с плотными средами, что позволяет добиться лучших результатов как по срокам, так и по эффективности культурального выявления микобактерий.

Отражением этого принципа является разработанная в дальнейшем, оригинальная и достаточно простая мануальная двухфазная система BBL Septi-Chek AFB, объединяющая в единое целое флакон с жидкой средой и косяки плотных сред.

Помимо жидкой фазы, бульона Middlebrook 7H9, в системе BBL Septi-Chek AFB

присутствуют три плотные среды: неселективный агар Middlebrook 7H11, яичная среда Левенштейна–Йенсена и шоколадный агар, которые формируют плотную фазу в атмосфере, обогащенной СО2. Посевной материал инокулируют в бульон, заполняющий флакон в нижней части системы. Ежедневно вручную флакон переворачивают, чтобы бульон омывал косяки. Помимо микобактерий на средах данной системы могут расти и другие микроорганизмы. Скорость роста микобактерий туберкулеза (МБТ) на Septi-Chek AFB выше, чем на изолированной плотной среде, но несколько ниже, чем на системе ВАСТЕС 460.

При очевидных достоинствах радиометрическая система BACTEC 460 имеет ряд недостатков – таких, как полуавтоматический мониторинг роста культуры, значительная трудоемкость операций, работа с радиоизотопами и необходимость утилизации радиоактивных отходов. Для их преодоления была предложена более совершенная технология флуоресцентной регистрации роста микроорганизмов, которая легла в основу разработки мануальной (неавтоматизированной) системы BBL MGIT (BD), появившейся в лабораториях с 1994 года.

Пробирка MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube), кроме 4 мл модифициро-

ванной среды Middlebrook 7Н9, содержит в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор – Трис 4,7-дифенил-1,10-фенантролин рутениум хлорид пен-

152 Культуральные методы диагностики туберкулеза

тагидрат, «погашенный» высокими концентрациями кислорода (рис. 24, а). В процессе потребления растущими клетками растворенного в среде О2 индикатор начинает светиться в лучах источника ультрафиолетового облучения (рис. 40). Увеличение микробной популяции сопровождается усилением свечения, интенсивность которого можно оценить при помощи трансиллюминатора или портативного светоизмерительного прибора Micromgit.

Относительно недорогая и компактная система BBL MGIT, предназначенная для быстрой культуральной диагностики микобактериозов и определения чувствительности микобактерий к лекарственным препаратам, может быть использована в качестве экспресс-метода, при полевых испытаниях, в условиях ограниченных ресурсов. В дальнейшем описанный принцип флуоресцентной детекции роста был использован при разработке полностью автоматизированной системы бульонного культивирования микобактерий BACTEC MGIT 960 (BD), которая, являясь наиболее совершенной среди существующих аналогичных систем, широко распространена в лабораториях всего мира.

Одна из коммерчески доступных автоматизированных систем MB/BacT была запатентована гол-

ландской фирмой Organon Teknika в 1995 г. на базе Флуоресценция пробирок MGIT Рис. 40

BacT/ALERT – системы для автоматического тестирования био- и гемокультур.

Для определения роста микобактерий в системе MB/BacT используется технология колориметрического СО2-детектирования. Уникальные MB/BacT-флаконы со штрихкодом содержат придонный сенсор, изменение цвета которого наблюдается при закислении среды вследствие микробного метаболизма, что регистрируется компьютером, который анализирует и интерпретирует данные.

Система MB/BacT состоит из нескольких инкубаторно-детекторных модулей (до 9), управляемых одним компьютером. Вместимость одного MB/BacT-модуля составляет 240 или 120 пробирок. Культуральный флакон MB/BacT, так же, как пробирка MGIT, содержит бульон Middlebrook 7Н9, который перед посевом диагностического материала обогащают питательными веществами, антиоксидантами и альбумином, связывающим токсины, которые образуются в процессе роста микроорганизмов. Для подавления контаминирующей микрофлоры, аналогично системам MGIT, использующим смесь бактериостатических препаратов PANTA, в бульон добавляют раствор, содержащий полимиксин, амфотерицин, налидиксовую кислоту, триметоприм, азлоциллин. Особенностью MB/BacT-флакона является закрепленная резиновая пробка, через которую иглой со шприцем инокулируют посевной материал, что, по-видимому, также позволяет предохранять жидкую среду от контаминации. После внесения исследуемого образца флаконы помещают в инкубаторно-детекторные блоки. Когда в 1 мл среды количество колониеобразующих единиц начинает превы-

шать 106, звуковой сигнал, сопровождающийся появлением информации на дисплее, указывает на завершение исследования.

В подавляющем большинстве случаев положительный результат, свидетельствующий о росте МБТ, регистрируется системой в течение 2–3 недель. При отрицательном результате удаление флаконов из инкубатора производят через 42 дня.

Другим более совершенным представителем вышеописанного семейства является система нового поколения BacT/ALERT 3D, которую представляет компания BioMerieux (рис. 41). Помимо выявления роста микобактерий система предназначена также для определения бактерий и грибов в гемокультурах.

Прибор состоит из контрольного модуля, под управлением которого могут находиться до 6 инкубационных модулей, рассчитанных на 60, 120 или 240 ячеек для процессорных флаконов. Инкубационный модуль состоит из выдвижных секций, имеющих по три блока на 20 ячеек каждый. При включении шейкера для стимуляции роста модуль работает в режиме получения гемокультуры. При отключении шейкера и использовании специальных программных алгоритмов для медленно растущих микроорганизмов модуль работает в режиме культивирования микобактерий. В системе BacT/ALERT 3D для получения бульонной культуры микобактерий применяют процессорные флаконы со средой Middlebrook 7Н9, такие же, как в системе МВ/ВасТ.

Значительным шагом в развитии ускоренных методов культурального выявления микобактерий стала инновационная система BACTEC MGIT 960 (BD), появившаяся в лабораториях в середине 90-х годов прошлого столетия. Она представляет собой

Рис. 41 Автоматическая система BacT/ALERT 3D

154 Культуральные методы диагностики туберкулеза

полностью автоматизированный комплекс для одновременной инкубации и мониторинга 960 пробирок (рис. 42). Прибор BACTEC 960 предназначен для исследования в течение года примерно 8000 образцов диагностического материала. Культивирование микобактерий осуществляется в индикаторной пробирке MGIT, содержащей 7 мл модифицированной среды Middlebrook 7H9. Данная система позволяет выявлять в клинических образцах большинство штаммов МБТ в течение 10–20 дней и определять лекарственную чувствительность культуры возбудителя в период, не превышающий двух недель.

Следует подчеркнуть, что BACTEC MGIT 960 является единственной полностью автоматизированной системой для определения лекарственной чувствительности микобактерий, которая обеспечивает ускоренное тестирование культуры ко всем препаратам первого ряда, в том числе и к пиразинамиду (рис. 43).

Автоматизированная система BACTEC MGIT 960 Рис. 42

Определение ЛЧ МБТ с помощью системы ВАСТЕС MGIT 960 Рис. 43

Как показали многочисленные испытания, внедрение диагностической цепочки, включающей, помимо традиционных плотных сред, систему ВАСТЕС MGIT 960, вдвое сокращает время получения культуры и определения лекарственной чувствительности микобактерий, увеличивает частоту обнаружения возбудителя в олигобактериальном материале от больных туберкулезом, а также повышает точность и воспроизводимость результатов микробиологического исследования.

Подробное описание культурального метода диагностики туберкулеза с использованием автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 изложено в Приложении 5.

3.2. Основные принципы культивирования микобактерий на жидких средах

Учитывая существенные трудозатраты персонала при выполнении процедур исследования, а также достаточно высокую стоимость расходных материалов, микробиологические исследования диагностического материала с использованием автоматизированных систем бульонного культивирования рекомендуется проводить в следующих случаях:

для дифференциальной диагностики туберкулеза;

впервые выявленным больным туберкулезом (не менее 1 раза до начала лечения или при поступлении в противотуберкулезное учреждение);

больным с распространенным и остро прогрессирующим туберкулезным процессом;

при рецидивах туберкулеза;

при прочих обстоятельствах, требующих получения культуры микобактерий в кратчайшие сроки.

Материалом исследования могут служить респираторные образцы, в первую очередь мокрота, любые биологические жидкости, кроме крови и мочи, а также отделяемое ран, промывные воды желудка и ткани организма, полученные при хирургических вмешательствах. Условия сбора диагностического материала и его качество должны соответствовать существующим требованиям, поскольку преаналитический этап оказывает значительное влияние на результаты исследования. Наиболее удобной емкостью для сбора клинических образцов следует считать стерильную градуированную пробирку на 50,0 мл с завинчивающейся крышкой, препятствующей разбрызгиванию материала при открывании. Оптимальное количество жидкого диагностического материала должно составлять примерно 5,0 мл.

Успех культурального исследования с помощью анализаторов в значительной степени зависит от качества пробоподготовки диагностического образца. Перед инокуляцией в жидкие среды разжижение и деконтаминацию материала реко­ мендуется проводить с использованием NALC-NAOH (по методу Kubika) с после-

дующим получением осадка в результате центрифугирования (при 3000 g в течение 15 минут). Этот метод позволяет преобразовать образец в сконцентрированную гомогенную взвесь, в которой практически уничтожена любая микрофлора, кроме микобактерий, сохранивших жизнеспособность. При такой обработке одним из факторов увеличения эффективности культурального (как и микроскопического) исследования является сохранение реакции среды, близкой к нейтральной

(рН 6,8).

156 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Выявление микобактерий с использованием автоматизированной системы бульонного культивирования обязательно предполагает параллельный посев образца на плотную яичную среду. Инокуляцию диагностического материала в жидкую среду проводят одновременно с посевом на плотную яичную среду, что необходимо для возможно более полного удовлетворения питательных потребностей микобактерий, которые могут дать рост только на одной из сред. Этот принцип позволяет также избежать некоторых ошибок, связанных с техническими погрешностями, неверной интерпретацией роста в позитивной пробирке и т. д.

С целью подтверждения принадлежности культуры, выросшей на жидкой среде любого анализатора, к комплексу МБТ необходимо проводить бактериоскопию по

Цилю–Нильсену и субкультивирование на плотной яичной среде содержимого по­ зитивной процессорной емкости. Использование ПЦР-анализа с целью дифференцировки комплекса МБТ и НТМБ при получении положительных результатов на автоматизированной системе может на 7 дней и более сократить время культуральной диагностики туберкулеза.

4Методы молекулярно-генетической диагностики микобактерий туберкулеза. Общая характеристика

и место в цикле диагностических исследований

Молекулярно-генетические методы основаны на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР), получившей широкое распространение в диагностике различных инфекционных агентов, том числе M. tuberculosis.

Принцип метода ПЦР состоит в амплификации – многократном, в миллионы раз, умножении участков специфической последовательности ДНК M. tuberculosis в пробирочном микрообъеме при циклическом повторении следующих 3 стадий реакции, каждая из которых проходит в различном температурном режиме:

1-я стадия – изменение структуры ДНК (денатурация) при нагревании с расхождением ее цепей;

2-я стадия – связывание с денатурированной ДНК синтетических последовательностей нуклеотидов (праймеров или затравочных олигонуклеотидов), комплементарных к концевым участкам фрагмента ДНК, специфичного для M. tuberculosis (гибридизация);

3-я стадия – синтез или достройка цепи ограниченного по флангам фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.

Многократное, в течение 40–50 циклов, удвоение специфичных фрагментов ДНК приводит к увеличению их количества в геометрической прогрессии до уровня, детектируемого существующими методами. Результаты ПЦР оценивают как с помощью агарозного гельэлектрофореза, при котором оценивается размер образовавшегося фрагмента ДНК, в сопоставлении со стандартными фрагментами ДНК с известным числом пар нуклеотидов (по расстоянию пробега от старта в виде флуоресцирующей полосы), так и с помощью различных методов гибридизации продукта со специфическими комплементарными мечеными олигонуклеотидами – ДНКзондами.

В1998 году была проведена полная расшифровка генома микобактерий туберкулеза. Это позволило выделить специфичные для генома микобактерий туберкулеза нуклеотидные последовательности ДНК, которые используются при ПЦР-выявле- нии МБТ в различных диагностических материалах в настоящее время.

Впоследнее время были разработаны коммерческие тест-системы (наборы реагентов) для выявления МБТ с использованием этих специфичных фрагментов ДНК. Некоторые из этих систем прошли государственные испытания и были зарегистрированы как в России, так и в других развитых странах.

Для подтверждения наличия микобактерий в диагностическом материале необходимо выделить ДНК микобактерий из клинического образца и затем провести ПЦР. Минимальное время, требующееся для проведения исследования, не превышает 2 часов.

Выявление возбудителя туберкулеза

Применение ПЦР-анализа для быстрого обнаружения возбудителя туберкулеза в диагностических материалах и идентификации M. tuberculosis отражено и в Приказе Минздрава РФ № 109 2003 года.

158 Культуральные методы диагностики туберкулеза

Наряду с высокой чувствительностью исследования при выявлении M. tuberculosis

вклинических образцах (10–100 клеток в образце) ПЦР имеет важнейшее преимущество для клинической практики, заключающееся в краткосрочности (1–2 дня) проведения анализа.

Чувствительность ПЦР при исследовании образцов мокроты больных туберкулезом составляет в среднем около 80%, а специфичность – не менее 99%. Возможность получения ложноположительных результатов при использовании технологии ПЦР

вдиагностике туберкулеза обусловлена внутрилабораторной контаминацией, в связи с тем что продукты амплификации (фрагменты ДНК) могут, особенно при использовании гельэлектрофореза, попадать в исследуемые образцы и служить матрицей для новых реакций, которые приводят к ложноположительным результатам. Однако развитие ПЦР-технологий и появление метода ПЦР в реальном времени резко уменьшило эту вероятность. Метод ПЦР в реальном времени позволяет детектировать результаты реакции на мониторе компьютера одновременно с проведением реакции в системе одной закрытой пробирки, в связи с чем продукты реакции не попадают во внешнюю среду. При этом используют флуорогенные ДНК-зонды, гибридизация которых приводит к измеряемому уровню флуоресценции, пропорционально количеству продукта реакции. Таким образом, могут быть получены количественные данные о наличии M. tuberculosis в исследуемом клиническом образце.

Видовая идентификация микобактерий

Метод ПЦР и метод ДНК-зондов могут быть использованы для быстрой видовой идентификации микобактерий. В частности, после получения положительного сигнала в ускоренных системах культивирования микобактерий типа BACTEC идентификация M. tuberculosis complex с помощью ПЦР может быть проведена в течение 3 часов. Применяемые в настоящее время тест-системы на основе ПЦР позволяют провести быстрое определение M. avium, и M. intracellulare и других медленно растущих видов микобактерий, имеющих клиническое значение, а также дифференцировать M. bovis (BCG) от вирулентных видов.

Исследование лекарственной чувствительности

Молекулярно-генетические методы на основе ПЦР-анализа используются и для быстрого определения лекарственной чувствительности МБТ. Разработанные методы позволяют определять лекарственную устойчивость пока в основном лишь в отношении рифампицина и изониазида. Это может быть проведено с помощью считывания (секвенирование) нуклеотидных последовательностей ДНК после амплификации в ПЦР участков хорошо изученных генов, ответственных за лекарственную чувствительность. Расшифровка специфических участков ДНК позволяет установить определенные точки мутаций, которые приводят к изменениям структуры рецептора лекарственного агента и потере лекарственной чувствительности микобактерий. Однако этот метод весьма дорог.

Для определения мутаций в генах, ответственных за лекарственную чувствительность, после проведения ПЦР используются различные методы, основанные на гибридизации амплифицированных участков с ДНК-зондами, комплементарных к мутантным последовательностям.

Хорошо апробирована известная коммерческая тест-система INNO-LIPA фирмы Innogenetics, Бельгия, для определения наиболее встречаемых мутаций к рифампицину, основанная на гибридизации продуктов ПЦР с зондами на нитроцеллюлозной мембране.

В России получил известность метод микробиочипов (зарегистрирован в РФ), основанный на этом принципе, но благодаря использованию большого числа коротких зондов, фиксированных в микрообъеме на поверхности предметного стекла, он позволяет выявить большее число точковых точечных мутаций, а результаты анализа оценивают с помощью компактного флуоресцентного микроскопа с компьютерным обеспечением. Метод был предложен для быстрого определения лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду.

Наряду с очевидными преимуществами ПЦР-методы имеют недостатки, связанные с возможностью внутрилабораторной контаминации продуктами ПЦР, поскольку для проведения анализа требуют нескольких последовательных стадий.

При использовании метода «ПЦР в реальном времени» применяется набор флуоресцентно меченных праймеров, комплементарных к сайтам мутаций, ответственных за возникновение лекарственной устойчивости. При этом исследование может проводиться в одну стадию в режиме закрытых пробирок. Результаты анализируются с помощью компьютерной программы.

Необходимо отметить, что молекулярные методы определения лекарственной устойчивости МБТ весьма эффективны при исследовании культур МБТ, однако для исследования непосредственно клинического материала (образцов мокроты) результаты могут быть получены в основном при наличии значительного бактериовыделения, т. е. образцы должны быть положительными по мазку.

Молекулярная эпидемиология туберкулеза

Задачами молекулярной эпидемиологии возбудителя туберкулеза могут быть: определение региональных характеристик штаммов возбудителя туберкулеза с последующим изучением связей (общих черт) между региональными штаммами и возможным анализом переноса инфекции в данный регион; изучение микровспышки (случаев заболевания в группе контактировавших лиц) туберкулеза; изучение роли суперинфекции возбудителя туберкулеза для реактивации или рецидива заболевания; определение возможности переноса инфекции в условиях фтизиатрического стационара; изучение роли переноса туберкулезной инфекции в распространении штаммов микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью.

Штаммовая, или внутривидовая, идентификация МБТ для эпидемиологического мониторинга, основанная на молекулярно-генетическом анализе, пока остается технологией научных исследований, однако ее практическое значение для контроля за туберкулезной инфекцией в конкретных регионах имеет очень большое значение уже в настоящее время.

Наиболее распространенным методом штаммовой идентификации МБТ является технология, называемая полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов (RFLP), которая основана на фрагментировании (рестрикции) ДНК МБТ и последующей гибридизации полученных фрагментов с определенными специфическими последовательностями на ДНК ее повторяемого элемента IS6110. Штаммы микобактерий туберкулеза различаются по количеству и размерам рестрикционных фрагментов. По-

160 Культуральные методы диагностики туберкулеза