2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Mikrobiologia_

В результате защитной деятельности этих иммуноглобулинов включаются механизмы иммунореактивности или иммунотолерантности. Благодаря индукции иммунологической толерантности в кишечнике не возникают нежелательные воспалительные реакции против кишечной микробиоты и пищевых белков.

Коротко: АГ попадает в просвет кишечник/на слизистые кишечника => ИГ распознают АГ => информация передается на ИКК слизистой оболочки => сенсибилизированные лимфоциты слизистой клонируют плазматические клетки (ПК) => ПК синтезируют IgA и IgM => включают механизмы иммунореактивности и иммунотолерантности (предотвращают воспалительные реакции)

15.Эпигеномика. Управляемый микробиоценоз. Микробная биосоциальность. Персонифицированная терапия.

В настоящее время существует понятие КОСТНОМОЗГОВАЯ ОСЬ – доказано, что при расстройствах нормальной микрофлоры ЖКТ у 60% пациентов, наблюдаются те или иные психиатрические расстройства. Механизм действия объясняют с точки зрения новой науки – эпигеномики

ЭПИГЕНОМИКА – это учение о наследственных изменениях в фенотипе, в экспрессии генов и посттрансляционных процессах генной продукции, не связанных с изменением в порядке расположения нуклеиновых последовательностей в ДНК.

В отличие от мутаций эпигеномные изменения возникают в результате биохимических реакций между ДНК, гистонами, продуцентами микробной клетки.

Эти реакции разнообразны:

Ковалентные модификации гистонов (метилирование; ацетилирование; фосфорилирование) – активация экспрессии гена

Метилирование ДНК (гипо-/гиперметилирование), т.е. добавление метильных групп к цитозину, за которым следует гуанин => приводит к подавлению экспрессии гена

Они не приводят к изменению структурной последовательности ДНК. То есть изменения фенотипических признаков может быть результатом вариаций структурной организации хроматина, определяющей активное или неактивное состояние генов, без изменения их нуклеотидных последовательностей – ЭПИМУТАЦИИ.

Основная роль в эпимутациях принадлежит низкомолекулярным продуктам, продуцируемых нормальной микрофлорой – метабиотики.

УПРАВЛЯЕМЫЙ МИКРОБИОЦЕНОЗ. МИКРОБНАЯ БИОСОЦИАЛЬНОСТЬ

Бактерии проявляют различные формы социального поведения (коммуникации), способности к контактному и дистантному общению и формируют многоклеточные коллективы, структура которых во многом напоминает сообщества высших животных

Координированное поведение клеток микроорганизмов проявляется в разных формах:

1)Афилиация - «взаимное притяжение» особей одного вида, группы, стремление «быть вместе».

2)Кооперация - объединение особей для совместного выполнения той или иной задачи.

3)Изоляция популяций друг от друга, отказ образовывать смешанные скопления - проявление избирательности афилиации. Это способствует структурированности и обособленности микробных социальных систем

4)Коллективная агрессия тоже встречается среди микробов. Например, некоторые бациллы вырабатывают антибиотики, превращающие клетки конкурирующих колоний в покоящиеся споры. «В результате данная колония обеспечивает себе монопольный доступ ко всем пищевым ресурсам»

Многие микробы активно обмениваются друг с другом информацией. Для этого они используют разнообразные «каналы связи»:

1) Контактная коммуникация: обмен сигналами через межклеточные контакты, в том числе цитоплазматические мостики - плазмодесмы),

2)Дистантная химическая: обмен разнообразными сигнальными веществами - ауторегуляторами, аутоиндукторами, феромонами.

3)Дистантная физическая: предполагаемый обмен информацией посредством электромагнитных и звуковых волн.

Персонализированная медицина (терапия) — также называемая персонифицированная медицина, прецизионная медицина, индивидуализированная медицина — представляет собой совокупность методов профилактики патологического состояния, диагностики и лечения в случае его возникновения, основанных на индивидуальных особенностях пациента.

***К подобным индивидуальным особенностям относят: генетические, эпигенетические, транскрипторные,

протеомные, метаболомные и метагеномные маркеры, а также совокупность вариативных фенотипических признаков — как всего организма пациента, так и его отдельных тканей или клеток.

16. Понятие «дисбиоз», методы изучения. Препараты для коррекции.

ДИСБАКТЕРИОЗ – это любые количественные или качественные изменения типичной для данного биотопа нормальной микрофлоры человека, возникающие в результате воздействия на макро и /или микроорганизм различных факторов экзогенного и эндогенного характера или являющиеся следствием каких-либо патологических процессов в организме.

Микробиологическими показателями дисбактериоза служат:

уменьшение общего количества бактерий нормальной микрофлоры;

появление или увеличение числа редко встречающихся в норме микроорганизмов;

изменение биохимических свойств штаммов нормальной микрофлоры и приобретение ими некоторых факторов вирулентности;

Ослабление антагонистической активности нормальной микрофлоры

ДИАГНОСТИКА

Диагностика нарушений микробиоценоза проводится с помощью бактериологического метода, ПЦРдиагностики, хроматомасс-спектрометрии и исследования метаболитов.

Перспективен метод газожидкостной хроматографии, основанный на определении короткоцепочечных жирных кислот — метаболитов, в основном анаэробов.

ПРИЧИНЫ РАЗВИТИЯ ДИСБАКТЕРИОЗА:

В период новорожденности: осложненное течение беременности и родов у матери, бактериальный вагиноз матери, низкая оценка по шкале Апгар, долгое пребывание в роддоме и возможность заселения организма ребенка госпитальными штаммами

У детей раннего возраста: неблагоприятный преморбидный фон, раннее искусственное вскармливание, диатез, рахит, анемия, физиологическая незрелость моторной функции кишечника

У детей дошкольного и школьного возраста: нерациональное питание, нахождение в закрытых коллективах, гормональная перестройка организма.

Клинические проявления дисбактериоза:

Дисбактериоз кишечника может проявляться в виде диареи, неспецифического колита, синдрома малой сорбции, дуоденита, язвенной болезни желудка, гастрита, гастроэнтерита

Дисбактериоз органов дыхания чаще протекает в форме нарушений со стороны дыхательных путей, бронхитов, бронхиолитов, хронических заболеваний легких.

Проявлениями дисбактериоза полости рта являются гингивиты, пародонтит, стоматит.

Дисбактериоз мочеполовой системы женщин протекает как вагиноз.

Взависимости от степени выраженности клинических проявлений выделяют несколько фаз дисбактериоза:

1 фаза. Латентная, компенсированная форма – дисбактериоз не сопровождается какими – либо клиническими проявлениями. Незначительные изменения в аэробной части микробиоценоза (увеличение/уменьшение количества кишечных палочек). Бифидо-/лактофлора не изменены. Кишечные дисфункции не регистрируются

2 фаза. Субкомпенсированная форма. В результате дисбаланса нормальной микрофлоры возникают локальные воспалительные процессы. На фоне незначительного снижения количественного содержания бифидобактерий выявляются количественные и качественные изменения кишечной палочки или других условно-патогенных МО

3 фаза. Значительное снижение уровня бифидофлоры в сочетании со снижением лактофлоры и низким содержанием кишечных палочек. Сопровождаются кишечными дисфункциями.

4 фаза. Отсутствие бифидофлоры, значительное уменьшение лактофлоры и изменение количества кишечной палочки (снижение/увеличение), возрастание численности условно-патогенных бактерий. Выраженные клинические проявления.

***Коррекция дисбактериоза:

Патогенетическая терапия – нейтрализация и выведение токсинов и условно-патогенных МО (назначение сорбентов)

Селективная деконтаминация

Бактериальная терапия – подавление развития патогенной и восстановление баланса собственной микрофлоры

Применение препаратов (см. ниже)

трансплантация

ПРЕПАРАТЫ КОРРЕКЦИИ ДИСБАКТЕРИОЗА

1)Пробиотики – живые микроорганизмы, обитатели нормальной микрофлоры кишечника (бифидосодержащие препараты, лакто содержащие препараты, коли содержащие препараты).

2)Симбиотики – это пробиотики, включающие в себя два или более штамма живых пробиотических микроорганизмов, оказывающих стимулирующие друг друга эффекты.

3)Пребиотики – препараты немикробного происхождения, способны стимулировать рост и процессы метаболизма представителей нормальной микрофлоры – это олигосахариды.

4)Синбиотики – это пробиотические комплексные продукты, в состав которых введены живые пробиотические микроорганизмы и пребиотические субстанции, стимулирующие их рост.

5)Комбиотики – варианты синбиотических средств, в состав которых помимо пробиотических микроорганизмов и пребиотиков, добавлены другие функциональные пищевые ингредиенты (витаминноминеральные премиксы, фенолсодержащие растительные соединения).

6)Аутобиотики – это пробиотики и продукты функционального питания на основе аутоштаммов и аутоассоциаций симбиотических микроорганизмов.

17.Генетический аппарат бактерий и его особенности. Плазмиды бактерий. Мобильные генетические элементы бактерий. CRISPRCAS бактерий.

Основное генетический материал представлен 2-нитевой суперспирализованной молекулой ДНК, замкнутой в кольцо и прикрепленной к ЦПМ – нуклеоид (хромосома)

Внехромосомный набор генов:

Плазмиды – несет доп. Информацию, молекулярная масса меньше нуклеоида

Подвижные элементы: IS-последовательности, транспозоны и интегроны

 ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА БАКТЕРИАЛЬНОЙ КЛЕТКИ:

а) ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ:

Основной генетический материал представлен нуклеоидом;

У прокариотов структурно-неоформленное ядро, т.е. без мембраны и ядрышек;

в нуклеоиде одна хромосома, поэтому нуклеоид=хромосома

в бактериальной клетке может быть дополнительное наследственное вещество – плазмида;

молекула ДНК нуклеоида и плазмиды прикрепляются одной нитью к ЦПМ

ДНК находится в цитоплазме

б) МОЛЕКУЛЯРНЫЕ:

хромосома бактерий имеет кольцевую структуру, суперспирализована

хромосома бактерий – чистая двунитчатая ДНК, не содержит гистонов (их роль выполняют полиамины)

в ДНК бактерий повышенное содержание метиллированных (минорных) азотистых оснований, они выполняют защитную функцию гистонов;

ДНК бактерий содержит IS-последовательности, строение которых аналогично таким же участкам ДНК у высших организмов;

отмечается выраженная изменчивость нуклеотидного состава: соотношение гуанина и цитозина (Г/Ц – индекс) у бактерий имеет видовые отличия

ПЛАЗМИДЫ – дополнительные, внехромосомные элементы наследственности

Плазмида, как и хромосома, представлена кольцевой молекулой двунитчатой ДНК, но ее размеры значительно меньше хромосомы

Плазмида содержит структурные гены, кодирующие тот или иной признак, гены автономной репликации, IS-последовательности

У некоторых плазмид есть гены, ответственные за ее трансмиссивность (перенос, передачу). Такие плазмиды называют трансмиссивными (конъюгативными).

Гены плазмид не несут обязательную информацию клетки, сообщают селективные преимущества

Молекулярная масса значительно меньше, чем у хромосомы

Плазмиды способны к автономной репликации ИЛИ их репликация находится под ослабленным контролем хромосомы

для плазмид с низкой молекулярной массой характерно явление амплификации (многокопийности);

молекула ДНК плазмид более подвержена воздействию физических и химических агентов, чем хромосомы; частота плазмидных мутаций выше, чем хромосомных

некоторые физические (УФ, СВЧ и др.) и химические агенты вызывают элиминацию (удаление, потеря) плазмид

плазмиды могут содержать tra-гены и самостоятельно передаваться в процессе конъюгации, это конъюгативные плазмиды

в клетке могут находиться несколько разных плазмид, но некоторые плазмиды несовместимы между собой; по этому признаку различают группы несовместимости плазмид

В клетке могут находится в одном из двух альтернативных состояний:

1. Либо они лежат свободно в цитоплазме и тогда их репликация идет автономно, то есть независимо от репликации хромосом. А так как они значительно меньших размеров, то реплицируются быстрее и в короткое время накапливается большое количество копий плазмид.

2. Если они находятся в интегрированом состоянии, то репликация их синхронна с репликацией хромосомы.

Функции плазмид:

регуляторная – в случае повреждения хромосомы, могут взять на себя ее функции

кодирующая – помогает выжить в определенных условиях; содержит структурные гены, отвечающие за устойчивость к АБ; отвечают за синтез экзотоксинов (энтеротоксинов в толстой кишке)

Плазмиды могут детерминировать разные свойства бактерий:

1.R-плазмиды – кодируют лекарственную устойчивость (АБ-устойчивость);

2.F-плазмида – определяет пол бактерий (передача генетической информации);

3.Col-плазмиды – синтез колицинов;

4.Hly-плазмиды – кодируют синтез гемолизинов;

5.Ent-плазмида – синтез энтеротоксинов;

6.Плазмиды биодеградации – расщепление органических и неорганических соединений

Наличие F-плазмиды (фактор фертильности, половой фактор) придает бактериям функции донора, и такие клетки способны передавать свою генетическую информацию другим, F – клеткам.

Таким образом, наличие F-плазмиды является генетическим выражением пола у бактерий.

С F-плазмидой связана не только донорская функция, но и некоторые другие фенотипические признаки. Это, в первую очередь, наличие F-пилей (половых ресничек), с помощью которых и устанавливается контакт между донорскими и реципиентными клетками. Через их канал и передается донорская ДНК при рекомбинации. На половых ресничках расположены рецепторы для мужских fi-фагов. F – клетки не имеют таких рецепторов и не чувствительны к таким фагам.

Особое значение в медицинской микробиологии занимают R-плазмиды, которые содержат набор генов, определяющих синтез ферментов, разрушающих антибиотики.

Такая плазмида делает бактериальную клетку невосприимчивой (резистентной) к определённому набору антибиотиков.

Многие R-плазмиды являются трансмиссивными, и они передаются между бактериальными клетками. Часто это приводит к появлению популяций, очень устойчивых к различным препаратам, что лежит в основе развития внутрибольничных инфекций.

_______________________________________________________________________________________________

К мобильным генетическим элементам относят:

IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ – нуклеотидные последовательности, не кодирующие вырезку белка, а ответственные за выделение транспозонов в молекулу ДНК.

ТРАНСПОЗОНЫ – участки ДНК, способные к перемещению внутри молекул и от одной к другой, могут быть переданы из клетки в клетку.

ИНТЕГРОНЫ — генетические элементы, которые содержат в себе ген интегразы, специфический сайт и рядом с ним промотор, что придает им способность интегрировать в себя мобильные генные кассеты и экспрессировать присутствующие в них беспромоторные гены.

 IS-последовательности - короткие фрагменты ДНК

Они не несут структурных (кодирующих тот или иной белок) генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (способность IS-последовательностей перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки)

* IS-последовательности одинаковы у разных бактерий

Отличительной особенностью IS элементов является наличие на концах вставочной последовательности инвертированных повторов. Эти инвертированные повторы узнает фермент транспозаза.

Транспозоны

–функционируют подобно IS-элементам, однако содержат не только гены перемещения, но и некоторое количество структурных генов (в среднем транспозон содержит от 1500 до 3000 п.н.). Это могут быть, например, гены устойчивости к антибиотикам; гены, определяющие продукцию факторов вирулентности и т.д.

ИНТЕГРОНЫ

Помимо плазмид и подвижных генетических элементов у бактерий существует еще одна система, способствующая распространению генов - система ИНТЕГРОНОВ. Интегроны являются системой захвата малых элементов ДНК, называемых генными кассетами.

Важное свойство мобильных генетических элементов: они не являются самостоятельными генетическими структурами! То есть они не способны к автономной репликации, а реплицируются только в составе репликона!!!

Роль мобильных генетических элементов:

1.Могут «выключать» ген при перемещении в новый участок;

2.Нередко приводят к мутациям: делеции или вставки новых последовательностей;

3.Определяют эволюцию микробных клеток.

CRISPR/Cas — это короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами (равноудаленно расположенные в геноме)

ЗДЕСЬ ПО СУТИ ВСЯ ИНФОРМАЦИЯ ПО ЭТОЙ СИСТЕМЕ (ВЕСЬ МЕХАНИЗМ)

Эти равноудаленно расположенные повторы различают отличающиеся участки – фрагменты встроившихся генов бактериофагов, которые в норме должны убить бактерию, но бактерия каким-то образом выжила (оставлю ссылку на видео, откуда взяла информацию). Однако оказалось, что у бактерий вырабатывается так ИС (белок Cas1/2, после внедрения бактериофагом фрагмента своего ДНК в клетку, опережает его и отрезает кусочек ДНК вируса (это обезвреживает вирусную ДНК) и сам вставляет в геном бактерии, и т.к. это неполная вирусная ДНК, она не нанесет вред бактерии.

Формирование бактериологической «иммунологической памяти»: клетка транскрибирует в РНК тот участок внедренного вирусного ДНК и второй белок Cas9 с помощью этой РНК обнаруживает идентичный фрагмент вирусной ДНК и срезает ее (она больше не несет опасности после этого).

ИММУНИТЕТ: Cas1/2 – отражает первую атаку и собирает данные. Cas9 – поднимает данные и отражает повторную атаку. (похож на адаптивный иммунитет человека)

– это система адаптивного приобретенного иммунитета бактерий и архей, направленная на уничтожение проникшей в клетку чужеродной ДНК, например, фагов или плазмид

- это метод редактирования генома организма

С помощью систем CRISPR-Cas бактерии способны «записывать» в собственный геном и передавать потомству информацию о фагах, с которыми они сталкивались в течение жизни. Наличие таких «воспоминаний» позволяет распознавать ДНК фага и эффективней противостоять ему при повторных инфекциях.

CRISPR-системы состоят из геномных кассет, в которые записывается информация о вирусных или плазмидных инвазиях, и Cas-белков, обеспечивающих молекулярный механизм иммунитета. В ответ на инфекцию клетка с CRISPR вырезает из чужеродного генома небольшой фрагмент и встраивает его в кассету.

*используется бактериями для защиты от очередной НК (прежде всего вирусов-фагов)

Палиндром – это нуклеотидная последовательность, которая одинаково читается справа налево и наоборот.

Кроме палиндромных повторов есть лидерные и спейсеры.

Спейсеры – это копии чужой, ранее проникшей в клетку НК. Бактериальная клетка оставляет в своем геноме копию, чтобы защитить от повторного попадания

Лидерные последовательности – к ним присоединяются спейсеры, отделяемые друг от друга палиндромными повторами.

Механизм действия: вирус второй раз попадает в клетку, впрыскивает НК (протоспейсер). В ККС есть гены, отвечающие за образование белков:

•Интерфирирующие РНК – связываются с протоспейсером

•Другие белки эндонуклеазы – разрушают образовавшийся комплекс

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КРИСПР КАС СИСТЕМЫ В МЕДИЦИНЕ (для общего развития лучше знать)

Белок Cas9 можно снабдить любой соответствующей РНК, чтобы с ее помощью он мог найти участок уже в геноме и порезать его. При этом не только в вирусах и бактериях, а вообще практически в любом организме (т.е. при помощи Cas9 вырезать ген, отвечающий за то или иное заболевание и заменить его здоровым).

***белки, которые режут ДНК – нуклеазы, но в отличие от Cas9 остальные делают это строго в определенных местах. Cas9 – единственная нуклеаза, которая может резать белок в любом месте, в котором ему «укажут».

18. Механизмы изменчивости бактерий. Рекомбинации у бактерий, их особенности

Механизма изменчивости бактерий:

Фенотипическая изменчивость – модификации (изменяются внешние признаки) − не затрагивает генотип.

Модификации затрагивают большинство особей популяции. Они не передаются по наследству и с течением времени затухают, т.е. возвращаются к исходному фенотипу через большее (длительные модификации) или меньшее (кратковременные модификации) число поколений.

 Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. Связана с изменением генетического аппарата. В

ее основе лежат мутации и рекомбинации.

МУТАЦИИ бактерий – это спонтанные изменения в последовательности отдельных нуклеотидов ДНК.

По протяженности изменений повреждения ДНК - различают мутации точечные, когда повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов и протяженные или аберрации.

* Мутации могут быть спонтанными, то есть возникающими самопроизвольно и индуцированные.

По локализации различают:

a)гниение – затрагивают один ген;

b)хромосомные – затрагивают группу генов;

c)плазмидные – затрагивают гены плазмид.

Механизмы мутаций:

выпадения нескольких пар нуклеотидов – делеции;

удвоение генетического фрагмента – дупликации;

перемещение фрагментов хромосомы – транслокации;

переворот участка ДНК на 180о – инверсии.

вставка нового гена

 Рекомбинации у бактерий, их особенности

РЕКОМБИНАЦИЯ – перераспределение генетического материала родителей в потомстве (обмен генетического материала, приводящий к появлению новых сочетаний генов)

В процессе рекомбинации условно выделяют клетку-донор, которая отдаёт часть своего генетического материала, и клетку-реципиент, которая этот материал воспринимает. В клетку-реципиент попадает часть генетического материала, поэтому говорят о формировании так называемой мерозиготы. В мерозиготе образуется один рекомбинант, большая часть генов которого представлена ДНК клетки-реципиента, а меньшая

– гены клетки-донора.

Особенности рекомбинаций у бактерий:

1.У них отсутствует мейоз и образуется не зигота, а мерозигота.

2.Однонаправленность переноса генетической информации (от донора к реципиенту)

3.Рекомбинанты содержат всю генетическую информацию реципиента и плюс часть генетической информации донора.

4.наличие нескольких механизмов рекомбинаций: конъюгация, трансформация, трансдукция, слияние протопластов.

МЕХАНИЗМЫ РЕКОМБИНАЦИЙ:

I.ТРАНСФОРМАЦИЯ – обмен генетической информацией путем введения в бактериальную клетку готового препарата ДНК

*При этом клетки реципиента должны быть компетентными, то есть готовыми воспринимать генетическую информацию. Компетентность реципиента обусловлена наличием особого белка компетентности, который - повышает проницаемость клеточной стенки и ЦПМ для ДНК, -ингибирует ДНК-азы и активирует синтез рестриктаз.

Это состояние наблюдается в процессе деления клетки. Таким образом, деление является оптимальным условием для трансформации.

*происходит при культивировании реципиента на питательной среде, содержащей ДНК донора (передаются единичные признаки)

II.ТРАНСДУКЦИЯ – обмен генетической информации путем передачи ее от донора к реципиенту с помощью умеренных (ТРАНСДУЦИРУЮЩИХ) фагов.

*способны переносить 1 и более генов (признаков)

*Трансдуцирующий фаг – это умеренный фаг, который в процессе лизогении захватывает соседние бактериальные гены и при инфицировании новых клеток встраивает эти гены в новый геном. При строгой специфичности фага захватываются и переносятся строго определенные гены.

*трансдукция бывает:

Специфическая – всегда переносит один и тот же ген; располагается в одном месте хромосомы

Неспецифическая – передаются разные гены; их локализация постоянна

III.КОНЪЮГАЦИЯ – обмен генетической информации путем передачи ее от донора к реципиенту при их прямом контакте (конъюгировании)

Передача ДНК осуществляется с помощью половых пилей

Необходима F-плазмида – определяют и контролируют процесс конъюгации

F-плазмиды кодируют образование половых пилей, по которой плазмидная ДНК передается в новую клетку

IV. ТРАНСФЕКЦИЯ – процесс введения нуклеиновой кислоты в клетки эукариот невирусным методом. Трансфецирование клеток — один из ведущих методов генной инженерии, заключающийся в изменения фенотипа путем введения в клетку чужеродной нуклеиновой кислоты.

19. Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний. Метагеномный анализ

Генетические методы применяются для обнаружения микроба в исследуемом материале без выделения чистой

культуры и определения таксономического положения микроба и внутривидовой идентификации

МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ВНУТРИВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ

1.Рестрикционный анализ – метод анализа двухцепочечных молекул ДНК, образованных после обработки ферментами – рестриктазами. Метод проходит в 3 этапа: выделение ДНК, рестрикция ДНК, электрофорез. Бактериальную хромосому

нарезают рестриктазами на множество фрагментов. Затем проводят электрофорез в пульсирующем электрическом поле, в результате которого фрагменты ДНК выстраиваются в зависимости от размера в шеренгу, образуя уникальный видоспецифический профиль. По сходству рестрикционных профилей изучаемого и известных видов микроорганизмов можно идентифицировать и типировать микроорганизмы

2.Определение плазмидного профиля – из бактериальной клетки выделяют плазмидную ДНК, которую выделяют электрофорезом в агарозном геле для определения количества и размеров плазмид.

3.Риботипирование – позволяет с помощью гибридизации обнаружить количественные различия по рибосомным оперонам и нуклеотидным последовательностям. Проводят гидролиз ДНК, которую разделяют в агарозном геле и затем гибридизируют с ДНК-зондами на 1 или более генов, кодирующих 16S-, 23S-, 5SрРНК.

МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ МИКРОБА БЕЗ ВЫДЕЛЕНИЯ ЕГО В ЧИСТУЮ КУЛЬТУРУ

1.Метод молекулярной гибридизации – позволяет выявить степень сходства различных ДНК (при идентификации МО – сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК эталонного штамма). ПРИНЦИП МЕТОДА:

2.Метод ДНК-чипов – ДНК-микрочипы используют для анализа изменения экспрессии генов, выявления однонуклеотидных полиформизмов, генотипирования или повторного секвенирования мутантных геномов. Микрочипы отличаются по конструкции, особенностям работы, точности, эффективности и стоимости

3.ПЦР являющаяся одним из методов ДНК-диагностики, позволяет увеличить число копий детектируемого участка генома (ДНК) бактерий или вирусов в миллионы раз с использованием фермента ДНК-полимеразы.

Тестируемый специфический для данного генома отрезок нуклеиновой кислоты многократно умножается (амплифицируется), что позволяет его идентифицировать. Сначала молекула ДНК бактерий или вирусов нагреванием разделяется на 2 цепи, затем в присутствии синтезированных ДНК-праймеров (последовательность нуклеотидов специфична для определяемого генома) происходит связывание их с комплементарными участками ДНК, синтезируется вторая цепь нуклеиновой кислоты вслед за каждым праймером в присутствии термостабильной ДНК-полимеразы. Получается две молекулы ДНК. Процесс многократно повторяется.

Для диагностики достаточно одной молекулы ДНК, то есть одной бактерии или вирусной частицы. Введение в реакцию дополнительного этапа - синтеза ДНК на молекуле РНК при помощи фермента обратной транскриптазы - позволило тестировать РНКвирусы, например, вирус гепатита С. ПЦР - это трехступенчатый процесс, повторяющийся циклично: денатурация, отжиг праймеров, синтез ДНК (полимеризация). Синтезированное количество ДНК идентифицируют методом иммуноферментного анализа или электрофореза.

В ПЦР может быть использован различный биологический материал - сыворотка или плазма крови, соскоб из уретры, биоптат, плевральная или спинномозговая жидкость и т.д. В первую очередь ЦПР применяют для диагностики инфекционных болезней, таких как вирусные гепатиты В, С, D, цитомегаловирусная инфекция, инфекционные заболевания, передающиеся половым путем (гонорея, хламидийная, микоплазменная, уреаплазменная инфекции), туберкулез, ВИЧ-инфекция и т.д.

Преимущество ПЦР в диагностике инфекционных заболеваний перед другими методами исследований заключается в следующем:

возбудитель инфекции может быть обнаружен в любой биологической среде организма, в т.ч. и материале, получаемом при биопсии;

возможна диагностика инфекционных болезней на самых ранних стадиях заболевания;

возможность количественной оценки результатов исследований (сколько вирусов или бактерий содержится в исследуемом материале);

высокая чувствительность метода; например, чувствительность ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В в крови составляет 0,001 пг/мл (приблизительно 4,0.102 копий/мл), в то время как метода гибридизации ДНК с использованием разветвленных зондов - 2,1 пг/мл (приблизительно 7,0.105 копий/мл).

4.Опосредованная транскрипцией амплификация рРНК –