2 курс / Микробиология 1 кафедра / Доп. материалы / Mikrobiologia_

инфекционными антителами иммунный комплекс и после повторной отмывки остается в системе. Учет результатов реакции осуществляется с помощью люминесцентного микроскопа. При положительном результате (в сыворотке найдены АТ) наблюдается специфическое свечение (рис. 3). Интенсивность свечения зависит от количества образовавшихся иммунных комплексов, а, следовательно, от количества антител в сыворотке обследуемого. При отрицательном результате свечение отсутствует (рис. 4). Метод нашел применение в серодиагностике герпеса, цитомегалии, лихорадки Ласса. Основной недостаток метода – это его субъективность, так как он основан на микроскопии и визуальном наблюдении.

2. Реакция прямой иммунофлюоресценции

*Применяется для иммуноиндикации. Используют для быстрого обнаружения АГ возбудителя в патологическом материале

Компоненты реакции:

Исследуемый материал от больного (хАГ)

Диагностическая сыворотка меченая флюорохромом (АТ)

Схема положительной прямой РИФ (см. рисунок)

Из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле как для обычной микроскопии. Препарат фиксируют. На поверхность фиксированного мазка наносят меченые ФИТЦ сыворотки или моноклональные антитела. Меченые флюорохромом антитела образуют с антигенами исследуемого материала иммунные комплексы, и после отмывки остаются в системе. Результат учитывают по интенсивности свечения комплексов АГ+АТ при люминисцентной микроскопии препарата.

 ИФА = РИФА

*Применяется в качестве метки фермента, способного расщеплять определенный субстрат

*Для этого метода характерны высокая чувствительность, высокая специфичность и простота учета результата

В основе метода лежит расщепление субстрата под действием фермента, которое выявляется изменением окраски индикатора в случае «+» результата. Количество расщепленного субстрата (интенсивность окраски)

будет пропорциональна количеству связавшейся меченной антиглобулиновой сыворотки, т.е. количеству

искомого компонента

Различают гомогенный и гетерогенный ИФА. Гетерогенный делится на конкурентный и неконкурентный, прямой и непрямой

Широкое распространение в диагностике инфекционных заболеваний получил твердофазный гетерогенный ИФА – ELISA. Применяется как для серодиагностики, так и для иммуноиндикации.

Известные АГ или АТ фиксируются на твердой фазе. Конечный результат анализа оценивают визуально и/или реакции с помощью специальных спектрометров или ИФА-ридеров по оптической плотности окрашенных продуктов

1. РИФА по обнаружению АТ (серодиагностическая ИФА)

Компоненты реакции:

Эталонный АГ

Исследуемая сыворотка (хАТ)

Антиглобулиновая сыворотка, меченная ферментом

Субстрат к ферменту, которым мечена антиглобулиновая сыворотка

Индикатор

Влунки полистиролового планшета адсорбируется известный антиген. Исследуемая сыворотка (хАТ) вносится в лунку планшета. При наличии в сыворотке соответствующих антигену антител, образуется комплекс АГ-АТ, прочно связанный с планшетом. Затем в лунки вносят антиглобулиновую сыворотку меченую ферментом. При образовании комплекса АГ-АТ, антитела антиглобулиновой сыворотки, меченной ферментом, взаимодействуют с антителами этого комплекса и образуется новый комплекс АГ+АТ+меченная ферментом антиглобулиновая сыворотка. Чтобы выявить этот комплекс, к нему добавляют субстрат для фермента и индикатор. Реакция фермент-субстрат ведет к изменению окраски индикатора (рис. 1). Если же в исследуемойсыворотке нет АТ к известному АГ, то комплекс АГ-АТ не образуется. Соответственно, не образуется комплекс АГ+АТ+меченая ферментом антиглобулиновая сыворотка и при добавлении субстрата не будет реакции фермент-субстрат и цвет реакционной смеси не изменится (рис. 2)

Схема положительной (рис. 1) и отрицательной (рис. 2) серодиагностической реакции ИФА

Для определения в образцах АГ (иммуноиндикация) широко применяется «сэндвич» вариант ИФА. Свое название данный метод получил из-за того, что первый и последний (третий) компоненты одинаковые – это АТ к искомому АГ, а между ними расположен АГ-компонент. Это напоминает бутерброд-сэндвич.

2. РИФА по обнаружению АГ

АТ адсорбируют на твердую фазу и в лунки вносят исследуемый материал (хАГ). После инкубации и отмывания в лунки вносят меченые ферментом АТ к искомому АГ. Снова инкубируют и отмывают, вносят субстрат. При изменении цвета говорят о «+» реакции. Если цвет среды в лунке не изменился, это указывает на то, что при последней отмывке меченая ферментом сыворотка удалилась из системы, поэтому разложения субстрата не произошло, а это возможно при отсутствии в исследуемом материале искомого АГ.

Схема непрямой «+» реакции ИФА (сэндвич-вариант)

В данной разновидности иммунодиагностической РИФА, берутся 2 диагностические сыворотки, содержащие АТ к искомому АГ, но полученные путем иммунизации двух разных животных - барана и кролика. Важно, чтобы на первом этапе использовалась баранья сыворотка, а на втором – кроличья, т.к. на третьем этапе добавляется меченая сыворотка, содержащая АТ против иммуноглобулинов кролика. Независимо от вида искомого АГ, используемая меченная сыворотка одного типа, что позволяет снизить стоимость данного диагностического метода

Схема непрямой «+» реакции ИФА

83. Иммунотерапия. Иммунобиологические препараты, применяемые для иммунотерапии

ИММУНОТЕРАПИЯ - это использование иммунологических закономерностей для лечения больных.

В основе данного метода лежит воздействие на систему иммунитета: восстановление, регулирование, временное замещение или подавление ее функций.

Для профилактики и лечения заболеваний большое значение имеет создание профилактических, диагностических и лечебных препаратов, объединяемых в группу иммунобиологических препаратов (ИБП).

По современной классификации А. А. Воробьева иммунологические препараты включают:

антигенные иммунобиологические препараты;

иммунобиологические препараты на основе антител;

иммуномодуляторы;

адаптогены – сложные химические вещества растительного происхождения, обладающие широким спектром биологической активности, действующие на иммунную систему;

диагностические препараты и системы для выявления антигенов и антител, ферментов, продуктов метаболизма, биологически активных веществ, чужеродных клеток для постановки кожных проб при аллергиях и иммунопатологических состояниях.

Эффект иммунобиологических препаратов:

Активное действие

Пассивное действие

85.Реакции иммунитета. Механизмы взаимодействия антигенов и антител. Простые и сложные реакции иммунитета.

Классификация реакций иммунитета

1)По количеству компонентов

простые – двухкомпонентные реакции (только АГ и АТ), они являются прямыми, то есть результат виден сразу после образования комплекса антиген-антител (АГ - АТ). К ним относятся реакции агглютинации и преципитации

сложные – это многокомпонентные непрямые реакции, результат которых невозможно увидеть без специальных систем для определения результата.

2)По характеру взаимодействия АТ с АГ

реакции агглютинации

реакция преципитации

реакции иммунного лизиса

реакции токсиннейтрализации

реакции вируснейтрализации

реакции с использованием меченых АТ или АГ

Простые прямые реакции иммунитета протекает в две фазы, которые различаются между собой по механизму и скорости.

Первая фаза (иммунологическая = фазы взаимодействия) - соединение активного центра антитела с соответствующими детерминантными группами антигена. Она специфична, но не видима.

Вторая фаза (физика – коллоидная = фаза проявления) – она не специфична, но видима.

*Первая фаза протекает всегда быстро в первые секунды или минуты реакции, а вторая значительнее медленнее, в течение нескольких часов.

 Сложные реакции иммунитета протекает в несколько фаз

Первая идентична простым реакциям, а характер последующих фаз иммунитета проявляются условиями их постановки и физическими свойствами антигена.

В реакции агглютинации принимает участие корпускулярный антиген, представляющий собой взвесь целых бактериальных клеток, в реакции преципитации антиген растворимый – это лизаты или экстракты из бактерий.

В реакции лизиса антиген тоже корпускулярный, но это реакция протекает только в присутствии комплимента.

В реакции токсиннейтрализации антиген представлен экзотоксинами бактерий, а в реакции вируснейтрализации – вирусами. Результаты реакций иммунитета регистрируются в виде нескольких основных феноменов (агглютинации, преципитации, лизиса, нейтрализации и др.), которые возможно наблюдать в лабораторных условиях.

Внастоящее время доказано, что природа АТ едина, различие в реакциях иммунитета определяется характером АГ и условиями постановки реакции.

Все реакции иммунитета:

1)высокоспецифичны, так как антитела могут взаимодействовать (соединяться) только со строго определенными (соответствующими) антигенами, которые и вызвали синтез данных антител. И это взаимодействие по типу замка и ключа.

2)Высокочувствительны, т.к. позволяют обнаружить единичные молекулы либо АГ, либо АТ

Все реакции иммунитета можно выразить следующей формулой:

АГ + AТ = РЕЗУЛЬТАТ

Первая часть этого равенства регистрируется и поэтому всегда известна.

Результат реакции иммунитета всегда альтернативен, он может быть либо «+», либо «-», поэтому, зная результат и один из компонентов, можно обнаружить другой неизвестный компонент (антиген или антитело).

Положительный результат будет в случае, когда антиген соответствует антителу

Отрицательный, когда антиген не соответствует антителу, поэтому зная результат и один из компонентов реакции, можно обнаружить другой неизвестный компонент.

Всвязи с этим все реакции иммунитета делят на две группы:

АГ + хАТ = Результат - реакции по обнаружению неизвестных антител;

хАГ + AТ = Результат - реакции по обнаружению неизвестных антигенов

86. Серодиагностика. Реакции иммунитета, применяемые для серодиагностики.

СЕРОДИАГНОСТИКА (от латинского serum – сыворотка) -этот метод диагностики, основанный на обнаружение антител в сыворотке обследуемого с помощью известного антигена.

Метод основан на способности антител сыворотки крови специфически связаться с соответствующими им антигенам. В медицинской практике применяется для диагностики инфекционных и некоторых неинфекционных заболеваний, для определения группы крови, для оценки напряжённости иммунитета, эффективности вакцин.

В сыворотке любого здорового человека присутствуют различные антитела, образовавшиеся после встречи с различными антигенами в течение жизни человека.

По происхождению различают несколько типов антител:

1)нормальные - это антитела, образовавшиеся в ответ на скрытую (бытовую) иммунизацию малыми дозами различных антигенов. Считают, что они могут играть определенную роль в формировании видового иммунитета. В сыворотки присутствуют в незначительном количестве;

2)постинфекционные - остаются после перенесенного инфекционного заболевания (продолжительность их циркуляции в сыворотке различная: от нескольких дней до десятков лет);

3)поствакцинальные - формируется после проведения активной иммунизации вакцинами или анатоксинами, продолжительность нахождения в сыворотке также различные, зависит от типа вакцин;

4)инфекционные - появляется вовремя инфекционного заболевания. Они отличаются от нормальных, постинфекционных и поствакцинальных тем, что количество их нарастает по мере развития заболевания. Однако при активной антибиотической терапии этого может не происходить.

Цель серодиагностики - обнаружении инфекционных антител в сыворотке крови больного человека.

Образование антител происходит две фазы:

1)индуктивная фаза - наступает сразу после введения антигены и продолжается 3-7 дней. Она характеризуется чувствительностью к ионизирующему излучению, не может быть воспроизведена in vitro и не переносится от донора к реципиенту. Во время данной фазы выявить антитела в сыворотки невозможно;

2)продуктивная фаза - наступает спустя 3-7 дней после введения АГ и продолжается достаточно длительный промежуток времени. Она воспроизводится in vitro, переносится от активно иммунизированного донора к реципиенту. В это время в сыворотке крови появляются антитела, выявляемые с помощью реакции иммунитета

Динамика накопления инфекционных антител также достаточно специфично:

постепенное нарастание => максимальное накопление => последующее снижение.

Это связано с предшествующим размножением возбудителя в организме больного, и, следовательно, с увеличением интенсивности антигенного раздражителя. Количество антител в сыворотке определяется их титром. Титр антител - это наибольшее разведение сыворотки, в котором ещё обнаруживаются антитела. Таким образом, титр инфекционных антител нарастает. Следовательно, диагностические реакции иммунитета необходимо повторять в ходе заболевания.

С этой целью применяется МЕТОД ПАРНЫХ СЫВОРОТОК. Парные сыворотки больного - сыворотки одного и того же больного, взятые в разные сроки болезни. Первый раз забор осуществляется на 5-8 день от начала заболевания, второй раз - на 10-16й (в этот срок их количество в сыворотке, как правило, максимально). Нормальные, постинфекционные и поствакцинальные АТ такой динамики не обнаруживают и остаются по мере развития заболевания на более или менее постоянном уровне.

Таким образом, инфекционные антитела можно отличить от других только по нарастанию их количество в сыворотке с 5 по 16 день заболевания.

Для получения сыворотки от обследуемого из локтевой вены забирают 5-10 мл крови, получают из неё сыворотку и разводят двухкратными разведениями. К каждому разведение сыворотки добавляют в строго определенное равное количество известного антигена, в качестве которого используют стандартные антигенные диагностические препараты - диагностикумы, содержащие взвесь убитых микроорганизмов (бактерий, вирусов, хламидий, риккетсий) или их отдельные антигены. Визуальные проявления положительного или отрицательного результата зависит от типа диагностикума, а, следовательно, реакции иммунитета.

В настоящее время для серодиагностики в основном используется ИФА, РПГА, реакция агглютинации.

Реакции, основанные на феномене преципитации, а также реакции латекс-агглютинации, коагглютинации для серодиагностики не применяются.

87. Иммуноиндикация. Реакции иммунитета, применяемые для иммуноиндикации

Иммуноиндикация – обнаружение неизвестного антигена в исследуемом материале (фекалии, кровь, ликвора, объекты внешней среды). Это самостоятельный экспресс-метод диагностики инфекционных заболеваний.

С помощью иммуноиндикации выявляют антигены и неинфекционной природы: гормоны (тест на беременность), опухолевые антигены.

Этот метод особенно широко используется для обнаружения (индикации) микробных антигенов в объектах внешней среде. Как правило, эти объекты, контаминированные большим количеством разных видов бактерий, и выделить чистую культуру искомого возбудителя достаточно трудно. Обнаружение же антигена в реакциях иммунитета задач не столь сложна и достаточно просто решаемая.

Принцип реакции иммуноиндикации с использованием реакции преципитации, меченых сывороток ( ИФА, РИФ, РИА,ИХА, и др.) нашли широкое применение в микробиологической диагностики. Объектом исследования при этом является различный материал от больного, в котором ищут антигены возбудителя.

При постановке реакции иммунитета по обнаружению АГ известным компонентом будут антитела гомологичные искомому антигену.

Такие АТ содержатся в сыворотках лабораторных животных, иммунизированных соответствующим антигеном -

ИММУННЫХ СЫВОРОТКАХ. В зависимости от способа получения различают агглютинирующие,

преципитирующие и др. сыворотки.

Общее название сывороток, содержащих известные антитела - ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ СЫВОРОТКИ.

Медицинская промышленность выпускает диагностические сыворотки в широком диапазоне номенклатур для обнаружения самых разнообразных микробных (и не только) антигенов.

88. Иммуноидентификация бактерий и вирусов. Реакции иммунитета, применяемые для иммуноидентификации бактерий и вирусов.

Важное место занимает реакции по обнаружению антигена при реализации основного метода микробиологической диагностики - бактериологического исследования. Такие реакции проводят с целью изучения антигенного строения известный чистые культуры, выделенные в ходе бактериологического исследования, то есть для её серологической идентификации. Это дает возможность определять не только вид, но и серогруппу или серовар.

Такие реакции иммунитета носит название реакций по идентификации, с этой целью используются только одна реакция - реакция агглютинации, соответственно она будет называться реакция агглютинации по идентификации.

Микроорганизмы содержат большое число различных по химическому строению и пространственной организации молекул, которые отсутствует в нашем организме, поэтому воспринимаются нашей иммунной системой как вещества, несущих отпечаток чужеродной генетической информации - то есть как антигены.

По локализации у микроорганизмов различают целлюлярные (соматические, капсульные, жгутиковые, фибриллярные) и экстрацеллюлярные - антигены экзотоксинов и экзоферментов.

Целлюлярные антигены связанны с самой бактериальной клеткой, то есть является корпускулярными.

А экзотоксины и экзоферменты – это белковые молекулы, синтезируемые бактериальной клеткой во внешнюю среду, они относятся к растворимым антигенам (в иммунодиагностике определение АГ экзоферментов не используется).

По специфичности различают:

1)Гетероантигены - общее с антигенами тканей и органов человека;

2)Группоспецифические – общие у микроорганизмов одного рода или семейства;

3)Видоспецифические - общего у микроорганизмов одного вида;

4)Вариантспецифические (типоспецифические) встречаются у отдельных штаммов микроорганизмов. По строению данных антигенов вид микроорганизма делится на серогруппы или серовары (серотипы).

Каждому типу антигенов соответствует антитела своей специфичности: перекрестно-регулирующие, групповые, видовые, вариантспецифические (типоспецифические).

Поскольку, в качестве неизвестного антигенного компонента выступает чистая культура, выделенная в ходе бактериологического исследования, реакция агглютинации по идентификации не является самостоятельным методом диагностики, а только одним из этапов бактериологического исследования.

89.Интерфероны: виды, механизм действия.

ИНТЕРФЕРОНЫ – группа белков с противовирусным действием, вырабатываемых эукариотическими клетками в ответ на внедрение в них ряда биологических агентов – интерфероногенов. Представляет собой семейство белков-гликопротеидов с молекулярной массой от 15 до 70 кДа.

Взависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделяют три типа: α, β и γ:

Альфа-интерферон вырабатывается лейкоцитами

бета-ИФ – фибробластами

гамма-ИФ – вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами, т. е. иммунными клетками.

Помимо противовирусного действия интерферон обладает противоопухолевой защитой, т.к. задерживает пролиферацию опухолевых клеток, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование В-клетками, активируя экспрессию главного комплекса гистосовместимости.

S1 – отвечает за связывание с рецептором клетки

S2 – участвует в слиянии вирусной оболочки клеточной мембраны

Культивирование:

Коронавирусы чувствительны к эфиру, детергентам, УФ, температуре (выше 56 С)

Для культивирования используются культуры клеток респираторного тракта человека (клетки VERO)

Размножение происходит в цитоплазме пораженных клеток

Источник заражения – человек

Путь передачи – воздушно-капельный

В результате взаимодействия S-белка вируса с рецепторами клетки, вирус проникает в эпителиальные клетки ВНП

После депротеинезации происходит репликация вирусной РНК и синтез вирусных белков

По окончанию сборки вирусных частиц вирионы покидают клетку путем почкования

Клетки эпителия ВДП могут поражаться как из-за цитологического действия, так и в результате иммунных механизмов

Инкубационный период – от 2-3 дней до 2-3 недель

Клиника:

Это острое респираторное заболевание ВДП

Повышение температуры тела, кашель (сухой, с небольшим отделением мокроты), одышка, утомляемость, ощущение заложенности в грудной клетке

Первые симптомы: головные боли, миалгии, спутанность сознания, кровохарканье, тошнота и рвота

Диагностика:

ПЦР

Иммуноиндикация (ИХА, ИФА, экспресс-метод)

Серодиагностика (… не поняла почерк)