Иммуноэлектрофорез

В данную группу объединены методы, конечный этап разделения которых основан на специфической реакции связывания антигена пробы с антителом добавляемой в носитель сыворотки, что позволяет определить состав исходной смеси антигенов. Существует несколько десятков модификаций иммуноэлектрофореза. Рассмотрим некоторые из них.

Классический иммуноэлектрофорез. На первом этапе производят разделение белков в забуференном агаровом или агарозном геле, а затем латерально, параллельно разделенным компонентам прорезают щели, которые заполняют антисывороткой. Выдерживают в течение некоторого времени для диффузии компонентов (обычно ночь). Взаимодействие антиген-антитело обнаруживается по дугам преципитации (рисунок 4.14). Метод позволяет выявить антигенный состав сложной смеси белков и идентифицировать отдельные компоненты смеси с помощью моноспецифических антисывороток. В клинике используется для типирования парапротеинов сыворотки и выявления белков Бенс-Джонса. Недостаток метода – отсутствие возможности количественного анализа.

Рисунок 4.14 – Схема классического варианта иммуноэлектрофореза

Процесс включает следующие стадии: 1) электрофоретическое разделение белков (антигенов) в геле; 2) внесение иммунной сыворотки в канавку, сформированную в геле; 3) диффундирование АГ и АТ в геле навстречу друг другу, в результате чего в месте их взаимодействия (при условии соответствия АГ и АТ) возникают дуги преципитации. Процесс иммунодиффузии продолжается около 24 часов во влажной камере; 3) промывка пластины геля для удаления белков, которые не участвовали в преципитации; 4) сушка и окрашивание образцов специальными красителями. Результат оценивают по количеству, положению и форме зон преципитации.

Иммуноэлектрофорез методом переноса. Основан на принципе классического иммуноэлектрофореза. Отличие состоит в том, что первичное электрофоретическое разделение производится на ацетатцеллюлозе, затем ацетатцеллюлозу переносят на поверхность чашки с агаром и на расстоянии 3-5 мм параллельно зоне электрофоретического разделения помещают полоски фильтровальной бумаги, смоченные соответствующей антисывороткой. При взаимодействии антигена и специфических антител образуются дуги преципитации. Преимущества метода – возможность более легкой идентификации отдельных белков (описанная методика уменьшает плотность дуг преципитации).

Ракетный имуноэлектрофорез (двумерный) происходит по схеме, представленной на рисунке 4.15.

Рисунок 4.15 – Схема проведения ракетного электрофореза

Электрофорез происходит в геле агарозы, содержащем специфические антитела. При этом антигены (Ag) движутся по направлению к аноду и взаимодействуют с АТ в геле. Это приводит к образованию длинных ракетоподобных участков преципитации, которые легко увидеть при окрашивании геля. Процесс завершается, конца зона преципитации образует на конце острие. Длина и площадь зоны преципитации пропорциональны концентрации исследуемого антигена.

Описанный метод позволяет провести количественное определение концентрации антигена, сравнивая тестовые и контрольные образцы, одновременно подвергшиеся электрофорезу. Общая продолжительность реакции 3-18 часов. Используется специальная электрофоретическая камера с охлаждением. Существует модификация данного метода с применением ацетат-целлюлозных мембран.