4.2.1. Способы детекции результатов иммунохимической реакции

Способ измерения результатов иммунохимической реакции зависит от характеристик антигена (размеры, количество, структура) и антител (авидность, специфичность). Возможны следующие варианты:

1. Прямая детекция – результат реакции можно наблюдать визуально. Примером может служить радиальная иммунодиффузия. Она основана на том, что расстояние, на которое передвигается антиген, взаимодействующий с антителом в геле, зависит от концентрации антигена (см. ниже). Для оценки концентрации анализируемого вещества измеряется диаметр окружности преципитата.

2. Непрямая детекция используется, когда прямая визуализация реакции невозможна (результат невидим). Но если лиганд связан с твердой фазой, то реакция становится видимой (пример – латексная агглютинация). Количественная оценка реакции осуществляется путем измерения степени мутности раствора (турбидиметрия).

3. Детекция на основе меченого антигена или антитела (immunoassay) применяется для обнаружения и определения антител (или антигенов) в низких концентрациях. Один из компонентов реакции (антиген или антитело) соединяют с веществом-меткой. В зависимости от применяемой метки количественный учет результатов реакции может быть различным:

• Фотометрия используется, например, при проведении иммуноферментного анализа. В результате фермент-субстратного взаимодействия образуется окрашенный раствор, который фотометрируется с помощью специальных вертикальных фотометров.

• Детекция флуоресценции основана на том, что один из компонентов реакции (антиген или антитело) метят специальными веществами (флюорофорами), которые при воздействии на них внешнего излучения возбуждаются и при переходе к покоящемуся состоянию испускают энергию в виде фотонов. Реакция регистрируется при помощи флюориметра.

• Детекция люминесценции основана на введении в реакцию АГ-АТ химических веществ (люминофоров), которые в процессе реакции окисления испускают свет определенной длины волны. Реакция окисления люминофоров может ускоряться определёнными медиаторами, такими как ионы металлов (хемилюминесценция), ферментами (биолюминесценция). Продуцируемый световой поток регистрируется при помощи люминометра.

• Детекция радиоактивности основана на использовании в качестве меток в реакции АГ-АТ радиоактивных изотопов (например, I¹²⁵, I¹³¹), которые в течение определенного промежутка времени распадаются с испусканием радиоактивной энергии (бета или гамма излучения). Реакция регистрируется при помощи бета, либо гамма счетчиков.

4.2.2. Краткий обзор некоторых иммунохимических тестов

Традиционный турбидиметрический тест

Может использоваться, если результатом взаимодействия АГ и АТ является появление мутности раствора (реакция преципитации). Степень мутности определяется турбидиметрически или нефелометрически. Метод применяется для определения концентрации белков, содержащихся в биологических жидкостях человека в достаточно высоких концентрациях (сывороточные иммуноглобулины классов А, М, G; компоненты комплемента – C3,C4; С-реактивный белок; трансферрин; аполипопротеины). Диапазон детекции – от 10^-3 до 10^-8 моль/л. Преимуществами этих тестов является возможность выполнения с использованием обычных фотометров, но при этом легкая адаптация к биохимическим анализаторам, быстрота выполнения

Латекс-тест. Принцип метода заключается в том, что на частицах латекса (диаметр от 15 до 600 нм) неспецифически адсорбированы антитела. При добавлении исследуемого материала (в случае наличия соответствующего антигена) происходит агглютинация частиц. Учет реакции может быть качественным (есть агглютинация или нет), полуколичественным (разводят сыворотку физиологическим раствором и учитывают максимальное разведение, при котором еще наступает агглютинация) или количественным (измеряется степень мутности пробы турбидиметрически, а затем концентрация анализируемого вещества рассчитывается при помощи калибровочной кривой).

Латексный турбидиметрический тест используется в случаях, когда анализируемое вещество содержится в пробе пациента в концентрациях ниже 10^-6 моль/л и называется в международной практике Latex Particle enhanced ImmunoAssay (LPIA). Используется для детекции белков, содержащихся в биоматериалах в низких концентрациях (ревматоидный фактор, антистрептолизин-О, ферритин). Диапазон детекции 10^-5 до 10^-11 моль/л.

Преимущества метода:

• бόльшая чувствительность по сравнению с традиционным турбидиметрическим тестом;

• быстрое выполнение теста.

Среди недостатков метода можно отметить ограниченную чувствительность.

Флуоресцентный поляризационный иммуноанализ (Fluorescence-Polarization Immuno- Assay(FPIA)

Это конкурентный тест, в котором искусственный антиген метят флуорофором (например, флуоресцеином), а свечение возбуждают поляризованным светом. Степень поляризации испускаемого света зависит от скорости вращения флюоресцентной метки в реакционной смеси. Если за время, прошедшее между поглощением возбуждающего света и его испусканием, молекула флюорофора не изменила своего положения в пространстве, тогда свет флюоресценции будет поляризован в той же плоскости, в которой поляризован и возбуждающий свет. Связывание меченого антигена с антителами препятствует вращению (то есть изменению местоположения) флюорофора в пространстве. После добавления пробы (исследуемого антигена) к этим реагентам, завершения иммунологической реакции и достижения между ними равновесного состо- яния реакционную смесь облучают поляризованным светом. Поскольку впоследствии измерение интенсивности флюоресцирующего света осуществляется в плоскости, перпендикулярной относительно плоскости поляризации возбуждающего света, детектируются молекулы свободного меченого флюорофором антигена, а молекулы меченого антигена, входящие в комплекс с антителом, не детектируются, поскольку весь излучаемый ими свет флюоресценции поляризован в той же плоскости, что и возбуждающий свет. Значения поляризации пересчитываются в концентрации при помощи калибровочной кривой.

Тест используется для детекции веществ с низкой молекулярной массой – гормонов (T4, кортизол и др.) и лекарственных веществ (теофиллин, фенитоин и др.). Диапазон детекции - от 10^-4 до 10^-10 моль/л. Недостатком технологии является невозможность адаптации к биохимическим автоанализаторам, а также ограниченность применения (только для низкомолекулярных веществ).

Радиальная иммунодифузия (рисунок 4.8)

Служит методом количественного определения белков, например, содержания иммуноглобулинов классов А, М, G в сыворотке крови. Диапазон детекции – от 10^-3 до 10^-7 моль/л.

Рисунок 4.8 – Схема реакции радиальной иммунодиффузии

Исследуемая проба (антиген – АГ) вносится в лунки геля, содержащего антитела, и диффундирует в нём по окружности. Концентрация внесённого в лунку антигена снижается по мере диффузии его в гель. В точке эквивалентности концентрации АГ и АТ формируются нерастворимые иммунные комплексы в виде кругов преципитации. Чем больше присутствует исследуемого вещества, тем дальше оно успевает продиффундировать, следовательно, тем больше диаметр кольца преципитации (верхняя часть рисунка). Концентрация исследуемого антигена устанавливается при помощи калибровочной линии, полученной при измерении диаметров колец, образуемых стандартным материалом с известной концентрацией антигена (нижняя часть рисунка).

Преимуществами данной технологии является простота, относительно низкая стоимость. Недостатки – большая продолжительность процесса преципитации (для определения сывороточных иммуноглобулинов – 24-72 часа), отсутствие возможности автоматизации, трудоемкость, субъективность оценки (особенно в измерении кольца преципитации), ограниченная чувствительность.

Тесты, основанные на принципе агглютинации

Агглютинация – процесс агрегации и осаждения различных частиц, суспензированных в водной среде. Оценка реакции осуществляется визуально. В качестве частиц-носителей используют латекс, бактерии или эритроциты, связанные с антигенами или антителами. В случае присутствия в исследуемом биологическом материале соответствующих антител или антигенов происходит образование конгломератов частиц. Тесты могут выполняться в пробирках либо на плоской поверхности. В клинической практике тесты агглютинации используются для определения ревматоидного фактора, С-реактивного белка, антистрептолизина-О и других веществ. Преимуществами технологии являются простота, быстрота выполнения и экономичность. Недостатки – относительно низкая чувствительность, невозможность автоматизации, субъективность оценки результатов, ограниченная область применения.

Тесты, основанные на технологии торможения процесса гемолиза

В качестве примера таких тестов приводим реакцию связывания комплемента (рисунок 4.9).

Рисунок 4.9 – Схема реакции связывания комплемента

Как видно из рисунка, кроме АГ и АТ в реагирующую смесь вводится третий компонент – комплемент, который способен связываться с комплексом АГ-АТ. Для обнаружения связывания комплемента используют дополнительную индикаторную гемолитическую систему – эритроциты барана, обработанные антисывороткой к эритроцитам барана. Лизис эритроцитов возможен только при наличии комплемента. Если антиген-диагностикум и исследуемые антитела (сыворотка больного) не образуют комплексов АГ-АТ, комплемент остается свободным и вызывает лизис эритроцитов (верхний рисунок). Если в опытной системе образовался комплекс АГ-АТ, который связал комплемент, лизиса эритроцитов в индикаторной гемолитической системе не наблюдается. При этом реакция связывания комплемента считается положительной (нижний рисунок).

Преимуществами данной технологии является простота, быстрота и экономичность, а недостатками – невозможность автоматизации, только полуколичественная оценка результатов, ограниченная область применения.