Глава 2. Собственные методы исследования и лечения.
Методы исследования у больных токсидермией.
В работе использовали как общепринятые, так и специальные методы исследования. До начала лечения и в процессе проводимой терапии больным токсидермией назначались общелабораторные исследования: клинический анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови и др. Иммунологические методы исследования.
Иммунологическое обследование больных проводили в соответствии с разработанной панелью стандартных тестов, рекомендованных ВОЗ (1987 г) и проблемной комиссией МЗ РФ по оценке иммунного статуса человека и эпидемиологии иммунодефицитов (1988 г).
Оценивали в динамике состояние иммунного статуса больных, который представляет собой комплекс информативных показателей, отражающих состояние различных звеньев иммунитета. Обследование включало определение количественных и функциональных показателей клеточного и гуморального звеньев иммунитета.
Иммуноферментный анализ.
Уровень цитокинов определяли в сыворотке крови больных токсидермией с помощью иммуноферментного анализа, используя наборы Pro-con (ООО «Протеиновый контур», Санкт-Петербург, Россия). Определяли уровень IL-1, IL-8, IL-10, ФНОα. и Г-КСФ.
До начала проведения анализа лунки планшета дважды промывали буферным раствором. Затем в лунки вносили по 10 мкл буфера В, при этом диапазон концентрации цитокинов становился от 20 пкг до 0,3 МЕ/мл. Добавляли по 100 мкл исследуемой сыворотки. Инкубировали 60 минут при
+25°С и непрерывном встряхивании. Удаляли жидкость и трижды промывали буферным раствором. После тщательной аспирации пипеткой вносили в каждую лунку по 200 мкл раствора вторых антител и инкубировали при температуре +37°С в течение 60 минут. Повторно
промывали и аспирировали жидкость из лунок, промывали дистиллированной водой, просушивали лунки и вносили по 200 мкл субстрата с красителем. Стрипы инкубировали при температуре +22°С 5-15 минут, останавливали реакцию добавлением 50 мкл раствора серной кислоты. Учет результатов проводили с использованием спектрофотометра при длине волны 450 нм, устанавливая нулевое поглощение по лунке со стандартом.
Определение активности естественных клеток - киллеров.
Для определения литической активности естественных клеток- киллеров (ЕКК) использовали стандартный 3H-уридиновый микроцитотоксический тест. Мононуклеарные клетки выделяли из гепаринизированной крови в градиенте плотности Ficoll-Pafue по методу Boyum, отмывали и ресуспендировали в среде RPMI 1640 («Flow», США), доводя до концентрации 10х106 клеток на 1 мл. Мишенями служили клетки мыши К562, меченные 3H-уридином. Суспензию мононуклеарных клеток, предварительно обработанную РНКазой А, а также клетки-мишени помещали в объеме 0,1 мл в микропластины фирмы «Nunc» (Дания). После 14-часовой инкубации при +37°С в атмосфере, содержащей 5% СО2, интактные клетки-мишени осаждали на фильтры марки 934-АН фирмы
«Whatman» (Великобритания). Остаточную радиоактивность определяли на счетчике - β излучения IS-2800 фирмы «Beekman» (США). Для количественной оценки литической активности ЕКК применяли цитотоксический индекс (ЦИ), рассчитываемый по формуле:
Контролем служили клетки-мишени, инкубированные в отсутствие лимфоцитов.
Определение МИФ.
Содержание МИФ в сыворотке крови и продукцию МИФ периферическими мононуклеарными клетками измеряли методом
энзимсвязанного иммуносорбентного анализа (ELISA). Для оценки соотношения МИФ/МСФ и анализа спонтанной клеточной миграции применяли скрининговый тест клеточной миграции из микрокультур (СМТК), предложенный А.П. Сусловым и соавт.
Иммунофенотипирование мононуклеарных клеток периферической крови проводили методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител серии ИКО. Учитывали относительное содержание антигенположительных клеток, выявляемое с помощью люминесцентного микроскопа Leitz. Содержание растворимых антигенов CD50+ и CD54+ (соответсвенно sCD50 и sCD54) определяли иммуноферментным методом с использованием моноклональных антител ИКО-60 и ИКО-184. Результаты выражали в условных единицах (U/мл. Содержание комплексов плазмин-макроглобулин анализировали с помощью твердофазного ИФА на основе тест системы, разработанной В.Н.Зориной (2001).
Определение уровня эндогенного оксида азота в сыворотке крови больных токсидермией.
Забор крови производился из локтевой вены. После 30 минутной экспозиции кровь центрифугировали при 2000g – 20 минут. Полученную сыворотку хранили при -20°С до следующего этапа исследования.
Количественный анализ содержания оксида азота (NO) в сыворотке крови оценивали по уровню его стабильных метаболитов – ионов NO2+NO3, определяемых спектрофотометрическим методом с использованием спектрофотометра DU-50 (BecKman, США) при длине волны 520 нм.
Предварительную обработку для количественного определения метаболитов оксида азота проводили следующим образом: для осаждения белка к 1 мл сыворотки крови добавляли 100 ил 35% сульфасалициловой кислоты. Пробы тщательно перемешивали и оставляли на 30 минут при комнатной температуре. Пробы центрифугировали при 5000g 15 минут на центрифуге J-21 (BecKman, США) для полного осаждения белка.
Супернатант после доведения pH 10 ил 5N NaOH до 7,4-8,0 использовали для определения метаболитов оксида азота.
Учитывая, что в водной среде нитрит ион крайне нестабилен и быстро переходит в нитрат ион, не регистрируемый спектрофотометрически, для количественного определения уровня оксида азота проводили предварительную обработку проб специальным индикаторным порошком, изготовленным ЗАО <Экоаналитик> (МГУ).
Индикаторный порошок представляет собой гомогеннум сухую смесь, содержащую цинковый порошок, сульфаниловую и хромотроновую кислоты и катализатор диазотизирования. После растворения порошка в анализируемом растворе биологического образца происходит восстановление нитрат иона в нитрит ион (процент выхода - 85%), который вступает в реакцию диазотирования – азосочетание с компонентом индикаторного порошка. При этом образуется окрашенное в красный цвет соединение, в концентрации пропорциональной содержанию нитрита в анализируемом растворе. Измерение оптической плотности образцов проводили через 15 минут после добавления реактива из расчета 20 мг индикатора на 1 мл образца. Расчет результатов производили по градуировочному графику, построенному по шести известным концентрациям NaNO3, полученный по вышеуказанной методике.
Статистическая обработка полученных данных проводилась методом вариационной статистики на персональном компьютере при использовании программ Microsoft Word и Microsoft Excel (Windows). Вычислялись средние арифметические значения (М), ошибки средних величин (m). Достоверность оценивали по критерию Стьюдента (t). Различия значений считали достоверными при уровне вероятности более 95% (p<0,05).
Таким образом, в настоящей работе были использованы современная аппаратура, широкий спектр клинико - лабораторных исследований и новые диагностические технологии.