4 курс / Дерматовенерология / Коллаген_в_косметической_дерматологии_Хабаров_В_Н

межмолекулярных ковалент-ных сшивок между группами лизина, аллизина, гидроксилизина или гидроксиаллизина через «шиффовы» основания (рис. 3.7).

Ковалентные связи такого типа встречаются только в коллагене и эластине. Прочность коллагеновых волокон обусловлена водородными связями между пептидными цепями коллагена, строением тройной спирали из полипептидных цепей, особенностями аминокислотного состава цепей и множеством ковалентных связей между молекулами тропоколлагена. В коже волокна коллагена расположены наподобие прутьев в плетеных изделиях и поэтому сопротивляются нагрузкам по всем направлениям. Размер, структуру и расположение коллагеновых фибрилл определяют клетки соединительной ткани. Они могут экс-прессировать один или несколько генов, кодирующих разные типы молекул, и таким образом влиять на все последующие этапы внутриклеточных и внеклеточных модификаций и обеспечивать укладку коллагеновых фибрилл. Коллагены I и III типов формируют прочные коллагеновые фибриллы. У коллагена IV типа концевые пептиды не отщепляются. Он образует не фибриллы, а сетчатые структуры базальных мембран. Их формирование происходит с участием N- и С-концевых пропептидов, содержащих остатки цистеина, которые не отщепляются, а образуют межцепочечные S-S-связи в сети коллагена.

Медицинские книги

@medknigi

Сформированные коллагеновые фибриллы укрепляются внутрице-почечными и межцепочечными ковалентными сшивками. Они образуются с помощью лизилоксидазы (медьсодержащий фермент), которая осуществляет окислительное дезаминирование ε-аминогрупп лизина и гидроксилизина с образованием реактивных альдегидов. Для этих реакций необходимы ионы меди, витамины РР и В6. Альдегиды далее формируют альдольные поперечные сшивки путём альдольной конденсации и альдиминные поперечные связи (шиффовы основания). Варьированием количества лизин-лизиновых сшивок достигается необходимая толщина и прочность коллагеновых волокон (рис. 3.8).

Коллагеновые волокна межклеточного матрикса обусловливают биофизические свойства дермы. Эластичность коллагеновой сети является важным фактором регулировки клеточных функций (Turlier et al., 2013). Формирующиеся со временем микрофибриллы, волокна, пучки в межклеточном веществе имеют разную растяжимость и прочность. В связи с этим изменяется и функциональная активность связанных с ними фибробластов. Наиболее динамично и адекватно на изменения в матриксе будут реагировать фибробласты, связанные конфокальными контактами с наиболее растяжимыми, вновь сформированными фибриллами коллагена (см. рис. 2.10) Увеличение толщины и прочности коллагеновых волокон и пучков в связи с увеличением ковалентных связей, прочностью и химических модификаций (неферментативного гликозилирования, карбамилирова-ния, билирубинирования) при «старении» коллагена будет снижать растяжимость волокон и, соответственно, активность и адекватность ответных реакций фибробластов на регуляторные сигналы из межклеточного матрикса.

В регуляции синтеза коллагена участвуют также гормоны. Глюко-кортикоиды тормозят синтез коллагена путём снижения транскрипции мРНК проколлагена, а также путём ингибирования активности ферментов пролилгидроксилазы и лизилгидроксилазы. Недостаточное гидроксилирование остатков пролина и лизина увеличивает доступность коллагена к действию коллагеназ и неспецифических протеаз. Макроскопически подавляющее действие глюкокортикоидов на синтез коллагена проявляется в уменьшении толщины дермы. Синтез коллагена кожи зависит также от содержания эстрогенов. Это подтверждается тем, что в менопаузе у женщин снижается содержание коллагена в дерме. Многие нарушения синтеза и структуры коллагена связаны с мутациями в генах коллагена (см. табл. 1.1).

Медицинские книги

@medknigi

Рис. 3.8. Этапы формирования коллагенового волокна (Северин и др., 2008)

Активность коллагеновых генов регулируется и эпигенетически, путём ацетилирования/деацетилирования гистоновых белков с участием ацетилтрансфераз (активаторов активности генов) и НАД+-зависимых деацетилаз (сиртуинов - белков-ингибиторов генной активности).

В заключение кратко суммируем последовательность регуляции синтеза, созревания и формирования коллагеновых волокон, которая включает следующие стадии (см. рис. 1.2, 1.3; табл. 3.1).

1. Регуляция генов коллагена на уровне транскрипции. После синтеза (транскрипции) первичные мРНК подвергаются фрагментации на интроны, экзоны и сборке «зрелой» мРНК из экзонов. Эти процессы сплайсинга первичных транскриптов мРНК проходят в ядре фибробла-стов, после чего функционально активные, «зрелые» мРНК транспортируются в цитоплазму клетки.

2.В цитоплазме процессы синтеза (трансляции) перемежаются с процессами сборки «заготовок» первичных коллагеновых макромолекул. Полирибосомы, содержащие «зрелую» коллагеновую мРНК, связываются с мембранами ЭПР и синтезируют сперва сигнальную последовательность полипептидной цепи из примерно 100 аминокислот. Благодаря сигнальной последовательности полипептидная цепь переправляется в цистерны ШЭР. Далее полимеризуется N- концевой пропептид из примерно 200 аминокислот, затем а-цепь коллагена из 1000 аминокислот, которую замыкает С-концевой пропептид из 250 аминокислот. Концевые пропептиды включают аминокислоту метионин. Синтезированная полипептидная цепь названа препроколлагеном («пре» указывает на наличие сигнального пептида, «про» - на наличие дополнительных пептидов на N- и С-концах). Затем начинается процессинг препроколлагена. Первичные полипептидные цепи, сформированные при участии шаперонов, подвергаются химической модификации. Основные этапы модификации - удаление сигнального пептида, гидроксилирование части пролиновых и лизиновых остатков, их гликозилирование, сборка тройных спиралей проколлагена. Все эти этапы созревания макромолекул проколлагена происходят в ЭПР, затем в аппарате Гольджи - внутриклеточно. Далее проколлагеновые молекулы посредством экзоцитоза переходят в межклеточный матрикс, где начинается неофибриллогенез.

3.В межклеточном матриксе от молекул проколлагена отщепляются С- и N- концевые пропептиды, которые внутри клетки направляли объединение а-цепей в трёхцепочечную молекулу проколлагена и предотвращали формирование фибрилл. Удаление концевых N- и С-пептидов от а-цепи коллагена катализирует внеклеточные ферменты: проколла-генаминопептидаза и проколлагенкарбоксипептидаза соответственно. В результате удаления концевых полипептидов проколлагена образуются макромолекулы тропоколлагена длиной 300 нм - основные структурные единицы коллагеновых фибрилл.

Медицинские книги

@medknigi

4. Процесс образования коллагеновых волокон основан на том, что растворимость тропоколлагеновых молекул почти в 1000 раз меньше, чем молекул проколлагена. Это свойство обеспечивает тенденцию молекул тропоколлагена к самоагрегации. Фибриллы образуются на поверхности клетки. После самосборки тропоколлагена между модифицированными остатками лизина и 5-гидроксилизина замыкаются поперечные ковалентные связи, которые стабилизируют фибриллы коллагена и обеспечивают их механическую прочность. Образование поперечных связей выполняет лизилоксидаза. Она катализирует окислительное дезаминирование ε-аминогруппы лизина в структуре коллагена. Коферментом этого фермента является пиридоксальфосфат, а кофактором - ионы меди. Образующиеся в

результате реакции альдегидные группы соседних молекул тропоколлагена соединяются между собой, обеспечивая образование ковалентных связей между молекулами, фибриллами и волокнами коллагена.

Таблица 3.1. Порядок и локализация процессинга препроколлагена

Самым важным фактором для построения полноценного коллагена является необходимая концентрация аминокислот, особенно глицина (Гли), пролина и лизина. Полипептидная цепь коллагена содержит около 1000 аминокислотных остатков. Это примерно 330 повторов Гли-Х-Y, где в позиции Х часто включен пролин, а в позиции Y - оксипролин. Лизин является незаменимой аминокислотой. При отсутствии хотя бы одной незаменимой аминокислоты синтез белков останавливается. Дефицит этих аминокислот может возникать потому, что они включаются во множество других метаболических путей. Например, глицин включается в синтез порфиринового кольца гема гемоглобина, где он является главным предшественником. Глицинучаствует также в синтезе креатина, пуриновых нуклеотидов, глутатиона, коферментов NAD, FAD, глюкозы, липидов, белков. Он используется в обезвреживании конечных метаболитов и ксенобиотиков путём конъюгирования с ними, а также для образования и использования одноуглеродных фрагментов. Между этими путями существуют конкурентные отношения. Поэтому необходимое содержание аминокислот глицина, пролина и лизина обеспечивает правильный синтез и самосборку коллагеновых структур. Глицин в повторяющихся последовательностях Гли-Х-Y обязателен, потому что радикал любой другой аминокислоты не помещается между тремя пептидными цепями при сборке тройной спирали. Глицин и пролин являются «жёсткими» аминокислотами и ограничивают вращение полипептидных цепей, что важно при самосборке коллагеновых структур. Недостаточное гидроксилирование пролина и лизина в пептидных цепях приводит к образованию менее стабильных и менее прочных

Медицинские книги

@medknigi

коллагеновых волокон, что повышает чувствительность коллагена к действию коллагеназы и неспецифических протеаз. Видимый результат со стороны кожи - ломкость кровеносных сосудов и множественные точечные кровоизлияния в коже. А при дальнейшем увеличении образования атипичного и легко разрушающегося коллагена ухудшаются механические свойства кожи. Часто эти дефекты синтеза и созревания коллагена связаны с недостатком аскорбиновой кислоты (витамина С), которая является коферментом гидроксилаз. Дефицит витамина С у морских свинок (синтез витамина С осуществляется у всех видов млекопитающих, кроме человека, обезьян и морских свинок) приводит к снижению содержания коллагена в различных органах (Девис и др., 1999). Аскорбиновая кислота предотвращает дальнейшее развитие патологии в этом направлении и восстанавливает необходимые скорости гидроксилирования и самосборки коллагена, снижает катаболизм коллагеновых структур.

Таким образом, суммируя вышеизложенное, ещё раз акцентируем внимание читателя на том, что синтез коллагена регулируется в фибробластах на уровне транскрипции коллагеновых генов. При этом в результате матричного синтеза образуется строго комплементарная матрице РНК - первичный транскрипт (пре-мРНК). Далее из этого длинного транскрипта «вырезаются» экзоны, соединяются друг с другом и образуется «зрелая» мРНК.

Такая сборка мРНК называется сплайсингом (от англ. splice - сращивать). Сплайсинг происходит в ядре. В цитоплазму поступает уже «зрелая» мРНК, где происходит снова матричный синтез (трансляция) первичных «избыточно» длинных полипептидов коллагена. После экзо-цитоза проколлангена в межклеточный матрикс заканчивается неоколла-генез, и с отщепления избыточных полипептидов и образования молекул тропоколлагена в межклеточном матриксе начинается период сборки фибрилл коллагена - неофибриллогенез. Таким образом, проявляется общая закономерность - после матричного синтеза РНК или белка следует период фрагментации биополимеров и сборки их функциональных структур.

Начальные процессы образования коллагеновых фибрилл (неофи-бриллогенеза) основаны на снижении примерно в 1000 раз растворимости тропоколлагена по сравнению с проколлагеном. Такое сильное увеличение гидрофобности тропоколлагеновых молекул обеспечивает их тенденцию к самосборке в нерастворимые коллагеновые фибриллы гидрофобными связями.

Матричные биосинтезы основаны главным образом на принципе комплементарности и коллинеарности. В самосборке и ферментативной сборке коллагеновой сети участвуют, кроме гидрофобных связей, и химические модификации «исходных деталей», но и в том и другом случае можно говорить о матричном принципе воспроизведении функционально активных биокомплексов. Образование биокомплексов фибриллярных волокон из тропоколлагена происходит на поверхности клетки с участием гидрофобных связей и укрепляется поперечными ковалентными связями между модифицированными остатками лизина и 5-гидроксилизина (рис. 3.9).

Медицинские книги

@medknigi

Матриксный фермент лизилоксидаза катализирует окислительное дезаминирование ε-аминогрупп лизина гидроксилизина в составе молекул коллагена с образованием альдегидных групп. Коферментом лизилоксидазы является пиридоксальфосфат (синтезируется из витамина В6), а кофактором служат ионы меди. Образующиеся в результате реакций альдегидные группы соседних молекул тропоколлагена соединяются между собой и обеспечивают образование ковалентных связей между фибриллами, волокнами, пучками. Образование поперечных ко-валентных связей обеспечивает одно из важнейших свойств коллагеновых волокон - их механическую прочность.

Рис. 3.9. Схема формирования коллагеновых фибрилл путем связывания макромолекул тропоколлагена ковалентными связями

«Молодой» коллаген содержит мало поперечных ковалентных связей и хорошо растворяется в солевых водных растворах. С возрастом при увеличении площади и веса ткани постепенно развивается «запрос» о повышении механической прочности коллагеновой сети дермы. Для этого увеличиваются диаметр и количество поперечных ковалентных связей в коллагеновых волокнах, уменьшается растворимость в солевых растворах. Повышение прочности снижает растяжимость волокон коллагена. Функциональная активность фибробластов, связанных с коллагеновыми волокнами, зависит от их растяжимости. Для восприятия биомеханических сигналов «матрикс-клетка» важна именно степень растяжимости. Увеличение механической прочности волокон снижает адекватность ответов клетка-матрикс. Одновременно с возрастом снижается и механохимическая трансдукция сигналов матриксклетка через пьезоэлектрические свойства ГК в связи со снижением её средней

Медицинские книги

@medknigi

молекулярной массы (Хабаров, Бойков, 2016). В этом же направлении действуют и спонтанные нерегулируемые химические модификации коллагена: гликирование, карбамилирование, билирубинирование и др. Так возникает порочный круг рассогласования процессов неоколлагенеза и неофибриллогенеза. Он может заключаться в развитии избыточного синтеза коллагена, который не может быть использован в затухающем неофибриллогенезе по причине «старения» и упрочения волокон и пучков коллагена.

3.3. КАТАБОЛИЗМ КОЛЛАГЕНА И ЭЛАСТИНА (МАТРИКСНЫЕ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ)

Главными ферментами катаболизма внеклеточных белков в организме являются матриксные металлопротеиназы (matrix metalloproteinases, MMP). Своё название они получили вследствие внеклеточной локализации и наличия в структуре ионов Zn2+ (Cerdà-Costa, Gomis-Rüth, 2014). Оптимум активности in

vitro отмечен для большинства ММР при щелочных рН=8,5 (Gioia et al., 2010). Синтез и секреция ММР осуществляются рядом нормальных клеток (нейтрофилами, моноцитами, макрофагами, фибробластами, остеокластами, хондроцитами, кератиноцитами, эндотелиальными и эпителиальными клетками), а также онкогенно-транс-формированными клетками (Рогова и др., 2011; Golubkov, Strongin, 2007). Большинство ММР локализуется в межклеточном матриксе, но некоторые (МТ-ММР) связаны с поверхностью клеток посредством «якорного» пептида (ММР-17, 25) или содержат трансмембранный домен (ММР-14, 15, 16, 24). МТ-ММР расщепляют примембранные белки, а также отщепляют внеклеточные домены рецепторов и других белков клеточной мембраны, что может приводить к высвобождению биологически активных пептидов (Онищенко, 2008; Zhao et al., 2015).

Функции ММР не ограничиваются только ремоделированием межклеточного матрикса, как это предполагалось до недавнего времени. Эксперименты на животных свидетельствуют, что, действуя на различные субстраты, ММР участвуют в регуляции таких физиологических процессов, как морфогенез, резорбция и ремоделирование тканей, ан-гиогенез, миграция, белковая адгезия, а также при различных патологических состояниях, включая рак (Соловьева,

1998; Stamenkovic, 2003; Fonseca et al., 2017; Phillips et al., 2017; Juchniewicz et al., 2017; Tokito, Jou-gasaki, 2016). Так, например, повышенная активность MMP-9 отмечена при воспалениях, ремоделировании ткани и её репарации, мобилизации матрикс-связанных факторов роста и процессинге цитокинов (Рогова и др., 2011). Её экспрессия коррелирует с десмоплазией (патологией, вызываемой неправильной ориентацией фибрилл коллагена). Повышенная экспрессия ММР-7 наблюдается при идиопатическом пульмо-нарном фиброзе (Bauer et al., 2017). Пониженная экспрессия ММР-2 и ММР-9 регистрируется при гемангиоме (hemangioma) (Taran et al., 2017).

Многие годы идут дебаты о возможной, предусмотренной эволюцией взаимозаменяемости некоторых ММР. Экстраклеточный матрикс характерен

Медицинские книги

@medknigi

преобладанием коллагена I типа, взаимодействие которого с эластином и фибронектином определяет подвижность клеток и их взаимодействие друг с другом. При нормальных физиологических условиях клетки «фиксированы» в матриксе, будучи связанными с волокнами коллагенов. При воспалениях и связанных с ними хронических патологиях (включая рак) возрастает активность матричных протеиназ, в первую очередь - коллагеназ ММР-1 и ММР-13. Эти ферменты деградации коллагена имеют большое структурное сходство, что в течение многих лет предполагало их одинаковую функциональную активность. Наличие двух этих ферментов, а не одного, объясняли обычной для соматической клетки склонностью к избыточности - иметь дубликат какогонибудь белка на случай повреждения гена одного из них. Другим объяснением было и остаётся то, что при «аварийных» ситуациях иметь активность двух практически идентичных белков лучше, чем одного. Результаты недавней работы большой группы израильских исследователей на фибробластах in vivo внесли значительные коррективы в устоявшееся представление об основных коллагеназах - ММР-1 и ММР-13 [Solomonov et al. 2016].

Во-первых, ими было показано, что эти ферменты узнают различные, специфичные для каждого из них, участки в молекуле коллагена I типа. При этом MMP-1 разрушает коллаген на более мелкие фрагменты, а MMP-13 способна деградировать и коллаген II типа. Структура фрагментов также отличается: MMP-1 производит прямые и одинаково ориентированные фибриллы, а MMP-13 - более тонкие и переплетённые.

Следствием активности этих коллагеназ по отдельности является различный характер связей фибробластов с матриксом и их подвижностью. Так, активность MMP-1 приводит со временем к образованию удлинённой морфологии клеток, а активность MMP-13 - к формированию округлой.

Во-вторых, авторами было показано [Solomonov et al., 2016], что увеличение по сравнению с нормой активности MMP-1 и MMP-13 приводило к изменению активности 3163 генов, главным образом вследствие активности каскадов реакций через киназы ERK1/2. Выводы из данной публикации позволяют утверждать, что в клетке даже близким по структуре и функциям ферментам, в частности коллагеназам, уготовлена своя уникальная роль. Кажущаяся избыточность наличия отдельных групп клеточных ферментов означает, что не все их функции пока установлены.

В этом контексте возникает очень важный вопрос: какие ММР абсолютно необходимы для выживаемости организма, и дефекты в каких ММР вызывают совместимые с жизнью патологии. Вследствие многообразия ММР установить связь между обнаруженным генетическим дефектом в отдельной ММР и фенотипом у человека очень сложно. Одним из пока немногочисленных результатов было обнаружение, что генетически обусловленный дефект структуры человеческой ММР-21 был причиной неправильного расположения органов при развитии эмбриона (Perles et al., 2015). В других исследованиях обнаружена связь между полиморфизмом в генах ММР-2, ММР-9 и/или ММР-7 в развитии депрессии, атеросклероза и аутоиммунных заболеваний (Bobinska et al., 2016; Li et al., 2017; Armstrong et al., 2017; Brown et al., 2017).

Медицинские книги

@medknigi