4 курс / Дерматовенерология / Диссертация_Рауш_Е_Р_Особенности_возбудителей_внутрибольничного

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова" Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

РАУШ

Екатерина Рудольфовна

ОСОБЕННОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ВНУТРИБОЛЬНИЧНОГО

ИНВАЗИВНОГО КАНДИДОЗА

03.02.12 – микология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор

Васильева Наталья Всеволодовна

Санкт-Петербург – 2015

2

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..5

ГЛАВА 1 Внутрибольничный инвазивный кандидоз - проблемы современной

лабораторной диагностики (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)………………………...10

1.1Краткая историческая справка……………………………………………...10

1.2Грибы рода Candida –возбудители инвазивного кандидоза………….…..14

1.3Современные подходы к видовой идентификации возбудителей инвазивного кандидоза……………………………………………………...21

1.4Чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к противогрибковым препаратам……………………………………………..31

1.5Современные методы определения чувствительности Candida spp. к

противогрибковым препаратам………………………………………….….35

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………………..43

2.1Объекты исследования………………………………………………………43

2.2Подготовка культур Candida spp. ……………………………………….…43

2.3Идентификация Candida spp. методом ДНК – секвенирования………….44

2.4Идентификация Candida spp. методом MALDI-TOF масс-

спектрометрии………………………………………………………………..46

2.4.1Изучение комплекса видов C. parapsilosis………………………….48

2.5Видовая идентификация возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза с помощью тест-системы AUXACOLOR2……………………..49

2.6Изучение морфологических особенностей возбудителей инвазивного кандидоз ……………………………………………………………………...49

2.7Методы определения чувствительности Candida spp. к противогрибковым препаратам in vitro …………………………...………………………………50

2.7.1Метод микроразведений в жидкой питательной среде - CLSI M27A3……………………………………………………………………….51

2.7.2Диско-диффузионный метод определения чувствительности - CLSI M44-А……...…………………………………………………………...54

3

2.7.3Определение чувствительности с помощью микробиологического анализатора Vitek 2 Compact…………..……………………………...55

2.8Статистическая обработка результатов……………………………………55

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3 Определение видового спектра клинических изолятов Candida

spp…………………………………………………………………………………56

3.1 Источники выделения возбудителей инвазивного

кандидоза……..……………………………………………………………….56

3.2Сравнение результатов видовой идентификации Candida spp. методами ДНК-секвенирования и MALDI-TOF масс-спектрометрии ………………57

3.3Сравнение результатов видовой идентификации штаммов Candida spp.

методами MALDI-TOF масс-спектрометрии и тест-системой

AUXACOLOR 2………………………………………………………………59

3.4Видовой спектр возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза

втечение 2012-2014 гг……………………………………………………….66

3.5Географические особенности этиологии инвазивного кандидоза ……….69

3.6 Морфологические особенности возбудителей инвазивного кандидоза....71

3.7Протеомное профилирование возбудителей инвазивного кандидоза……81

3.8Молекулярно-генетические особенности возбудителей инвазивного кандидоза ……………………………………………………………………..83

ГЛАВА 4 Определение чувствительности клинических изолятов Candida spp.

кпротивогрибковым препаратам…………………………………...…………..89

4.1Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза методом CLSI M27-A3…………………………………..……..89

4.1.1МПК противогрибковых препаратов для различных видов Candida spp…………………………………………………….………………...92

4.2Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного

4

ГЛАВА 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………..108

ВЫВОДЫ………………………………………………………………….……119

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ……………………………………….121

ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ…………………………………..…122

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ………………………………….....123

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………………………………………………...124

5

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Микромицеты рода Candida из состава нормальной микробиоты тела человека могут быть возбудителями внутрибольничного инвазивного кандидоза. Ежегодно в мире выявляют до 200000 пациентов с внутри-

больничным инвазивным кандидозом (ИК), из которых 100000 больных умирают [115]. Несмотря на то, что основными возбудителями ИК остаются

C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei, в последнее десятилетие отмечают нарастание доли C. не-albicans видов, в том числе редких [37, 41].

Известно, что лишь у 50 - 75% больных ИК удается выявить Candida spp. при посевах крови. Даже в случаях, когда удается выделить культуру

Candida, большинство используемых в микробиологической лаборатории методов видовой идентификации дрожжей обеспечивают получение резуль-

тата только через 2 суток и более. Кроме того, особую проблему составляет быстрая и надежная идентификация C. не-albicans видов [37]. В последние годы все чаще сообщают о появлении резистентных штаммов возбудителей ИК [39]. Однако, существует не только проблема устойчивости Candida spp.

к противогрибковым препаратам, но и проблема выбора метода определения чувствительности клинически значимых дрожжей к антимикотикам.

Несмотря на перспективность современных методов молекулярной биологии для точной видовой идентификации и быстрого выявления рези-

стентности грибов к противогрибковым препаратам, использование этих методов в повседневной диагностической практике ограничено.

Таким образом, быстрое установление этиологии ИК и определение чувствительности возбудителей к противогрибковым препаратам современ-

ными методами является актуальной проблемой.

Степень разработанности темы

В последние годы, благодаря внедрению современных методов, в том числе ДНК-секвенирования и технологии MALDI-TOF масс-спектрометрии,

6

этиология ИК в ряде зарубежных стран постоянно уточняется [35]. В иссле-

довании ИК в отделениях реанимации и интенсивной терапии,

проводившемся в России ранее, использовали только морфологические и биохимические методы видовой идентификации возбудителей [9]. При этом до 10% штаммов Candida spp. не удавалось определить до вида.

В период с 2003 по 2008 гг. в России в рамках многоцентрового глобального исследования ARTEMIS DISK была определена чувствительность возбудителей ИК к флуконазолу (78%) стандартизованным диско-диффузионным методом CLSI M44-A [15].

Однако отсутствуют сведения о чувствительности возбудителей ИК в РФ к антимикотическим препаратам, в том числе сравнительно нового поколения: вориконазолу, каспофунгину и позаконазолу, полученные рефе-

рентными методами. Введение новых критериев интерпретации результатов определения чувствительности для основных возбудителей ИК, предложен-

ных Европейским комитетом по определению чувствительности микро-

организмов к антибиотикам (EUCAST, 2012 г.) и Институтом по клини-

ческим и лабораторным стандартам (CLSI, США, 2012 г.) обусловило необходимость проведения оценки различных методов определения чувстви-

тельности Candida spp. к противогрибковым препаратам [40].

Цель исследования - изучить особенности возбудителей внутри-

больничного инвазивного кандидоза для оптимизации лабораторной диа-

гностики.

Задачи исследования:

1. Определить видовой спектр возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в стационарах РФ с помощью современных методов иден-

тификации.

2.Сравнить используемые методы видовой идентификации Candida spp. и

выявить наиболее эффективные для применения в рутинной практике.

3.Определить чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к современным антимикотикам с помощью стандартизованных методов (CLSI

7

M27-A3, CLSI M44-A) и микробиологического анализатора (VITEK 2

Compact).

4. Сравнить используемые методы определения чувствительности Candida spp. к современным антимикотикам и выявить наиболее эффективный для применения в рутинной практике.

5. Разработать алгоритм лабораторной диагностики внутрибольничного инвазивного кандидоза.

Научная новизна исследования

Впервые:

1.Установлена этиология внутрибольничного инвазивного кандидоза в РФ современными молекулярно-биологическими методами.

Соотношение видов C. albicans и C. не-albicans видов составляет 1:1,3.

Выявлены географические особенности этиологии инвазивного кандидоза в различных регионах России.

2.Определены профили чувствительности возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в России референтным методом CLSI M27-A3 к следующим противогрибковым препаратам:

флуконазолу, вориконазолу, каспофунгину, позаконазолу.

3.Установлены диапазоны МПК, МПК50, МПК90 флуконазола,

вориконазола, каспофунгина, позаконазола для возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в России.

4.Определены масс-спектро-профили возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза, в том числе редких видов Candida; внутри вида

C. parapsilosis выявлено 5 субкластеров.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты диссертационного исследования вносят вклад в изучение глобальных тенденций в этиологии внутрибольничного инвазивного кандидоза и определение чувствительности возбудителей ИК к анти-

микотическим препаратам; они также важны для быстрой и точной иден-

тификации патогенов - возбудителей внутрибольничного инвазивного канди-

8

доза. Собранная в результате исследования коллекция чувствительных и резистентных к противогрибковым препаратам изолятов Candida spp. от пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом депонирована в Российскую коллекцию патогенных грибов и служит основой для изучения молекулярных механизмов резистентности к азоловым препаратам.

Разработан алгоритм лабораторной диагностики возбудителей внутри-

больничного инвазивного кандидоза с помощью современных методов.

Методология и методы исследования

Данная диссертационная работа - многоцентровое исследование. Объекты исследования – культуры Candida spp., выделенные от пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом. Для выполнения работы использовали микробиологические, физико-химические, молекулярно-генетические и статистические методы.

Положения, выносимые на защиту:

1. Возбудители внутрибольничного инвазивного кандидоза в России представлены основными видами Candida spp. (96%): C. albicans,

C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii и

редкими (4%): C. lusitanie, C. dubliniensis, C. pararugosa, C. bracarensis, C. kefyr, C. lipolytica, C. utilis, C. inconspicua.

2. Распространенность C. albicans как основного возбудителя инвазивного кандидоза в России снизилась с 54% в 2012 г. до 32,8% в

2014 г. (р=0,015), C. parapsilosis - возросла с 9,8% (2012 г.) до 27,8%

(2014 г., р=0,01), тогда как уровень C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei

остается неизменным.

3.Чувствительность изолятов C. не-albicans видов к флуконазолу in vitro

составила 58%, к вориконазолу - 95,7%. К каспофунгину все штаммы возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза были чувствительны.

Степень достоверности и апробация результатов диссертационного

исследования

9

Степень достоверности результатов, полученных при проведении иссле-

дования, подтверждается достаточным и репрезентативным объёмом выбор-

ки выполненных исследований, подтверждена адекватными методами статистической обработки данных. Методы математической обработки полученных результатов соответствуют поставленным задачам.

Материалы диссертационного исследования представлены на конферен-

циях и конгрессах:

международных – 12-я конференция Американского общества микробиологов «Candida и кандидоз», США, 2014 г.,

европейских: 23-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Германия, 2013г.; 6-й конгресс «Тенденции в медицинской микологии», Дания, 2013г.; 24-й Европейский конгресс по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям, Испания, 2014 г.,

российских: Всероссийская научно-практическая конференция по медицинской микробиологии и клинической микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2013 г., 2014 г.); отчетные сессии научных под-

разделений СЗГМУ им. И.И.Мечникова, (Санкт-Петербург, 2013 г., 2014 г.).

По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в т. ч. 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.

Личный вклад диссертанта. Автор лично выполнил основные микро-

биологические исследования по теме диссертации, статистическую обра-

ботку, анализ полученных данных, обобщение и оформление результатов.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на

146 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литера-

туры, описания методов и материалов исследования, результатов работы,

заключения, выводов, практических рекомендаций. Диссертация содержит 25

таблиц и 42 рисунка. В работе использованы 30 отечественных и 154 ино-

странных источников литературы.

10

ГЛАВА 1 Проблемы современной лабораторной диагностики возбудителей инвазивного кандидоза (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Краткая историческая справка

История грибов рода Candida и вызываемых ими заболеваний началась более двух тысячелетий назад. Еще греческий ученый Гиппократ (460 – 377

гг. до н.э.) изучал заболевание «молочница» или aphta alba, названное так из-

за белых округлых язв на слизистых оболочках полости рта. Однако идентификация возбудителя «молочницы» слизистых оболочек была проведена лишь в XIX веке [14].

В период с 1839 по 1844 годы трое европейских ученых: Fredrik Berg (г.

Стокгольм), David Gruby (г. Париж), John Bennett (г. Эдинбург), независимо друг от друга, провели исследование кандидоза слизистой оболочки щек у детей. В 1841 году F. Berg в результате микроскопического выявления нитей гриба между эпителиальными клетками удалось обнаружить, что причиной афтозного поражения слизистых оболочек щек являются грибы, схожие с плесенями. В 1853 году французский биолог Charles Robin зарисовал и назвал гриб Oidium albicans (рисунок 1).