4 курс / Дерматовенерология / Диссертация_Рауш_Е_Р_Особенности_возбудителей_внутрибольничного

81

Таким образом, выявлено, что у некоторых видов Candida существует сходство между собой как по внешнему виду колоний, так и дрожжевых клеток, что затрудняет их дифференцировку. Особенно важно, что подобные совпадения обнаружены между часто встречающимися и редкими видами.

3.7Протеомное профилирование возбудителей инвазивного кандидоза

Всвязи с установленной тенденцией к увеличению встречаемости комплекса видов C. parapsilosis среди C. не-albicans видов, нами был изучен состав этого комплекса с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии (рисунок 33).

Показатель отличия

Рисунок 33 – Дендрограмма белковых масс-спектров штаммов C. parapsilosis (n=65). №№ 1–5 –номера субкластеров

Проведенным иерархическим кластерным анализом основных массспектропрофилей комплекса C. parapsilosis выявлено, что все исследуемые штаммы комплекса принадлежали только к виду C. parapsilosis. Изолятов C.

82

orthopsilosis, C. metapsilosis в России не обнаружено. Все полученные массспектры были распределены по 5 субкластерам сообразно их родству между собой. Дальнейшее, более подробное, деление также происходило по принципу родства. Были обнаружены близкородственные масс-спектры у некоторых изолятов, которые были выделены в одних и тех же городах, в одних и тех же стационарах, в один промежуток времени, но от разных пациентов (изоляты №№ 29, 30, 31 – г. Москва , №№ 14, 15 – г. Тюмень, №№ 24, 42 – г. Санкт-Петербург). Также выявлено, что изоляты №№ 21 и 39, устойчивые к флуконазолу, располагались в субкластере № 2, а изоляты №№ 24 и 41 находились в субкластере №3 и обладали устойчивостью и к вориконазолу (изолят №41).

В качестве дополнения базы данных масс-спектропрофилей Bruker 3.1 для улучшения идентификации редких видов Candida нами были добавлены их масс-спектры (рисунок 34).

Рисунок 34 – Масс-спектро профили редких возбудителей ИК: а – С. utilis, б -

C. lusitaniae, в – C. kefyr, г – C. bracarensis.

83

При сравнении масс-спектров C. parapsilosis, выделенных в России с масс-спектрами тест-штаммов из зарубежных коллекций микроорганизмов,

приведенныхв базе данных Bruker Biotyper обнаружили различие белковых масс-спектропрофилей C. parapsilosis исследуемых штаммов от зарубежных коллекций типовых культур (рисунок 35). Также установлено, что масс-

спектр штамма C. bracarensis, выделенный в России отличается от масс-

спектров штаммов находящимся в Центральном бюро грибных культур в Нидерландах (рисунок 36). При сравнении масс-спектро-профилей штамма C. utilis, выделенного в РФ, со штаммами из зарубежных коллекций наоборот выявлено близкое сходство между ними (рисунок 37).

Таким образом, протеомные профили редких видов Candida spp.

различны, что диктует необходимость дальнейшего наблюдения за видовым спектром, циркулирующим на территории России.

3.8 Молекулярно-генетические особенности возбудителей инвазивного

кандидоза

Для исследования полиморфизма региона D1/D2 гена 28S рРНК нами был выбран вид C. parapsilosis, которому принадлежит ведущая роль в развитии инвазивного кандидоза, вызванного C. не-albicans. В ходе исследования было получено 11 последовательностей данного региона для исследуемых штаммов C. parapsilosis, четырёх – для контрольных (типовые штаммы РКПГ), а также одного клинического штамма с не определённой чувствительностью к противогрибковым препаратам.

Полученные последовательности были выравнены и обрезаны по самым коротким, длина окончательного выравнивания составила 416 пар нуклеотидов (рисунок 38). Исключение составил штамм A., для которого удалось получить последовательность длиной только в 318 п.н.

85

Показатель отличия

Рисунок 36 – Масс-спектры исследуемых штаммов и штаммов из зарубежных коллекций C. bracarensis.

86

Показатель отличия

Рисунок 37 – Масс-спектры исследуемых штаммов и зарубежных коллекций C. utilis

87

Рисунок 38 – Выравненные последовательности региона D1/D2 гена 28S

рРНК C. parapsilosis.

В пределах полученного выравнивания нами было выявлено шесть полиморфных вариантов (однонуклеотидных замен) (таблица 12).

88

Таблица 12 – Обнаруженные Однонуклеотидные полиморфные варианты региона D1/D2 гена 28S рРНК C. parapsilosis.

Однонуклеотидные замены нуклеотидов были зарегистрированы в анализируемой последовательности в позициях 23, 73, 80, 102, 372, 409,

считая от начала выравнивания. Устойчивые к азолам штаммы C. parapsilosis

(М4_2 и A.) оказались в группе 11 штаммов с основным типом последовательности региона D1/D2. Таким образом, ген 28S рРНК штаммов

C. parapsilosis, выделенных от пациентов с микологической патологией г.

Санкт-Петербурга, имеет однонуклеотидные полиморфные варианты.

Однако имеющегося материала пока недостаточно для того, чтобы сделать определённые выводы о практической ценности изучения последовательности локуса D1/D2 гена 28S рРНК Candida spp. для выявления резистентных изолятов. Вместе с тем, в настоящей работе сделан задел для такого исследования — создана коллекция устойчивых изолятов,

для которых может быть проведено молекулярно-генетическое типирование.

89

ГЛАВА 4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ CANDIDA SPP. К ПРОТИВОГРИБКОВЫМ ПРЕПАРАТАМ

4.1Результаты определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза методом CLSI M27-A3.

В период с 2011 по 2014 гг. был проведен мониторинг чувствительности возбудителей ВБИК к противогрибковым препаратам по протоколу CLSI M27-A3 (с оценкой по критериям CLSI M27-S3 (2008 г.) и

M27-S4 (2012 г.) (таблица 13).

Таблица 13 – Результаты определения чувствительности штаммов Candida spp. к азоловым антимикотикам (CLSI M27-A3).

90

Продолжение таблицы 13

Примечание * критерии CLSI M27-S4, ** критерии CLSI M27-S4; Ч-

чувствительный, УЧ-умеренно - чувствительный, У устойчивый

Из 322 изолятов Candida spp. были чувствительны к флуконазолу 75%,

умеренно – чувствительными - 13% штаммов, устойчивыми – 12%. C.albicans

были чувствительны в 97% случаев, умеренно чувствительными - 0,7% и

устойчивыми 2,3%. Среди C. не-albicans штаммов 58% были чувствительными, умеренно – чувствительными – 23%; устойчивыми -19% (рисунок 39а). Таким образом, наибольший процент штаммов со сниженной чувствительностью к флуконазолу наблюдали среди видов C. не-albicans: C. glabrata (37), C. krusei (21), C. parapsilosis (8), C. tropicalis (2).