4 курс / Дерматовенерология / Диссертация_Рауш_Е_Р_Особенности_возбудителей_внутрибольничного

31

анализа составило 30 минут при низких затратах на расходные материалы

[56].

Следовательно, MALDI-TOF масс-спектрометрия является методом быстрой и точной идентификации с низкой себестоимостью. Однако,

возможны затруднения в идентификации видов, если их масс-спектры отсутствуют или единичные в базе данных масс-спектрометра.

Чувствительность микромицета к противогрибковым препаратам тесно связана с его видовой принадлежностью, в связи с чем необходим постоянный мониторинг и видового спектра и чувствительности к противогрибковым препаратам, в том числе нового поколения.

1.4 Чувствительность возбудителей инвазивного кандидоза к

противогрибковым препаратам

Первые данные о появление устойчивости возбудителей ИК к группе азоловых противогрибковых препаратов появились еще в 90-х годах у больных СПИД с сопутствующим инвазивным кандидозом [105]. Оксман и соавторы в исследовании ИК в двух многопрофильных центрах в США обнаружили, что 19% Candida spp. были устойчивы к флуконазолу, причем каждый третий штамм имел приобретенную устойчивость [44].

Отмечают, что C. albicans является преимущественно чувствительным видом к антимикотикам, однако описаны механизмы устойчивости к флуконазолу с потенциальной перекрестной устойчивостью к противогрибковым препаратам азоловой группы. В исследовании ARTEMIS DISK (1997–2007 гг.) выявлено, что устойчивость штаммов C. albicans к

флуконазолу с 2001 по 2007 гг. составляла в среднем от 1,0% – 1,6%. В

исследовании бразильских ученых среди 212 изолятов Candida spp. уровень устойчивых к флуконазолу C. albicans составлял 7,1%, тогда как у C. glabrata - 14.9%, C. tropicalis - 18,4% [143]. В исследовании, проведенном в Сан-

Антонио (США), среди устойчивых к флуконазолу C. albicans была обнаружена также устойчивость к каспофунгину – 8,1%. Также обнаружена

32

тенденция, что значительно больше изолятов имею устойчивость к каспофинугину и вориконазолу, если у них наблюдается устойчивость к флуконазолу [51]. Известно, что в последнее время наблюдается смещение видового спектра возбудителей ИК от хорошо чувствительной С. albicans к

малочувствительным к азолам изолятам C. не-albicans [133].

Так, у вида C. parapsilosis, который наряду с C. glabrata часто встречаются как возбудители ИК, стали обнаруживать сниженную чувствительность к препаратам азоловой группы и к эхинокандинам.

Сообщают о высоком уровне устойчивости к флуконазолу, который стал встречаться намного чаще у C. parapsilosis (6,8%) и C. tropicalis (9,0%), чем у

C. albicans (2,0%) и C. dubliniensis (3,9%) [58]. Ранее в исследовании

SENTRY сообщали, что 99% штаммов Candida spp. были чувствительны к каспофунгину, однако в последние годы обнаружено, что в связи с частым использованием эхинокандинов возрос уровень ИК, вызванного C. parapsilosis [110]. В исследовании, проведенном в странах Африки и Ближнего Востока, было обнаружено, что доля штаммов со сниженной чувствительностью к флуконазолу составляет 20%, а к вориконазолу – 14% [156].

В исследовании ARTEMIS DISK (2001 – 2007 гг.) выявлено, что устойчивость к флуконазолу у штаммов C. parapsilosis составляла 3,6%, а к вориконазолу – 1,8%. C. glabrata обладала устойчивостью к флуконазолу в

15,7% случаев, к вориконазолу – 10% [36]. Также было отмечено, что среди редких видов, таких как C. lusitaniae, устойчивость к флуконазолу составила

5,4%, а к вориконазолу – 2,0%, у C. rugosa – 41,8% и 21,2%, соответственно.

C. inconspicua была устойчива к флуконазолу в 53,2% случаев, к

вориконазолу – 3,9%. Среди штаммов C. utilis к обоим противогрибковым препаратам устойчивости не наблюдали [66].

У штаммов комплекса C. glabrata (C. nivariensis, C. bracarensis)

чувствительность к антимикотикам различна. У C. glabrata вероятно развитие множественной устойчивости к противогрибковым препаратам

33

[131]. По данным ARTEMIS DISK, доля штаммов C. glabrata, устойчивых к

флуконазолу была от 6% до 30%. В глобальном исследовании SENTRY (2008

–2009 гг.) обнаружили, что устойчивость C. glabrata к вориконазолу составила 11,1%, а к эхинокандинам – 16,7%, тогда как среди изолятов C. tropicalis обнаружено лишь 1,9% устойчивых к флуконазолу штаммов и 1,3%

–к вориконазолу. В исследовании Oxman et al. также было выявлено 13%

устойчивых к флуконазолу штаммов C. glabrata с перекрестной устойчивостью к эхинокандинам [44]. В настоящее время данный вид является умеренно-чувствительным к флуконазолу. В исследовании 137

штаммов C. glabrata, было выделено 3 изолята C. bracarensis, один из которых был устойчив к противогрибковым препаратам [29, 34]. C. krusei

является природно устойчивым видом к флуконазолу, чувствительны из них к вориконазолу – 83% штаммов; к эхинокандинам, в частности к каспофунгину, изоляты как правило чувствительны. У штаммов C. lusitaniae

отмечено быстрое развитие вторичной устойчивости к амфотерицину В [29, 94].

По данным исследования ARTEMIS DISK отмечено, что у C. guilliermondii снижается чувствительность к флуконазолу, эхинокандинам и амфотерицину В [29, 36].

У редкого вида C. rugosa зарубежными учеными обнаружена тенденция к снижению чувствительности к флуконазолу, эхинокандинам и амфотерицину В [113]. Вид C. inconspicua является чувствительным к каспофунгину, тогда как к азоловым антимикотикам чувствительность снижена. В исследовании ARTEMIS DISK доля устойчивых к флуконазолу составила изолятов C. inconspicua 53,2%, к вориконазолу – 3,9% [89].

Большинство штаммов C. kefyr являются чувствительными к противогрибковым препаратам, однако выявляют случаи устойчивости к каспофунгину [26, 29, 137].

В последнее время наравне с увеличением встречаемости C. dubliniensis

возрастает и устойчивость этого вида к флуконазолу. Так, при исследовании

34

41 изолята C. dubliniensis и 44 штаммов C. albicans было обнаружено, что у C. dubliniensis начинает развиваться стабильная устойчивость к флуконазолу при длительном лечении этим препаратом [29, 117].

Национальные эпидемиологические исследования, проведенные в разных странах, обнаружили ряд особенностей в отношении использования противогрибковых препаратов для терапии ИК (амфотерицин В, флуконазол,

и группе эхинокандинов), что может быть одной из причин появления резистентных штаммов.

Имеются наблюдения о географических различиях в распространенности устойчивых к вориконазолу штаммов Candida spp., так в Северной Америке - 14,6%, в других странах - 8,2 –11,3% [69].

Исследование, проводившееся в Китае в период с 2009 – 2011 выявило,

что среди C. albicans чувствительными к флуконазолу были 74,2%, к

вориконазолу – 100%, среди изолятов C. parapsilosis – 57.7% и 100%

соответственно, у C. glabrata чувствительность составила 9,1% и 100% к

вышеуказанным антимикотикам. У C. tropicalis – 31.6% , к каспофунгину все

100% штаммов были чувствительны, кроме 91.3% C. tropicalis [24].

В испанском национальном исследовании FUNGEMYCA (2009 –2011

гг.) было выявлено, что устойчивых и умеренно чувствительных среди C. albicans к флуконазолу было 1,5%, к вориконазолу – 1,6%, к позаконазолу - 1,9%. У C. parapsilosis сниженной чувствительностью к позаконазолу и каспофунгину обладали 0,3% штаммов, к флуконазолу и вориконазолу –не выявлено. Для изолятов C. glabrata наибольшая доля со сниженной чувствительностью наблюдалась для позаконазола – 14,5%, у флуконазола и вориконазола – 6,3% и 1,2% соотвественно, у каспофунгина устойчивых штаммов не обнаружено. Устойчивых к флуконазолу и вориконазолу у изолятов C. tropicalis было обнаружено – 5,3%, а к позаконазолу – 7,1%, к

каспофунгину также устойчивых не было [79]. По данным исследования

ROCANET в Италии (10 госпиталей, 2013 г.) среди 101 Candida spp. была установлена устойчивость к эхинокандинам у 2 штаммов (C. albicans и C.

35

tropicalis), к флуконазолу у 4 штаммов (2 C. glabrata), 1 штамм C. glabrata

имели устойчивость к вориконазолу и позаконазолу (перекрестная устойчивость) [157].

В Российской Федерации исследований распространенности устойчивости к противогрибковым препаратам не проводили.

1.5 Современные методы определения чувствительности Candida spp. к

противогрибковым препаратам

История развития референтных методов определения чувствительности насчитывает порядка 20 лет. Однако до этого дня основными были методы нестандартизованных серийных разведений и диско-диффузионные методы.

Проблема внутрилабораторной и межлабораторной воспроизводимости данных методов привели к необходимости применения стандартизованных методов. На сегодняшний день в мире существуют два крупных мировых центра по разработке стандартных методов определения чувствительности микромицетов к противогрибковым препаратам – CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute – Институт клинических и лабораторных стандартов,

США) и EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

–Европейский коммитет по исследованию противомикробной чувствительности).

CLSI в 1992 году разработал первый вариант протокола метода разведений в жидкой питательной среде M27-P. Время проведения исследований этим методом составляло 48 – 72 часа [74]. Благодаря совершенствованию протокола в 2008 году был предложен готовый протокол

M27-A3 с дополнением S3, где время получения результата составляло 48

часов [47]. Данный метод является референтным методом определения чувствительности. Однако, несмотря на точность получаемых результатов,

является трудозатратным и дорогим. В связи с этим, в 2004 году был разработан протокол диско-диффузионного метода CLSI M44-A [46],

36

характеризующийся простой пробоподготовкой, автоматическим учетом результата и высокой сопоставимостью результатов с референтным методом

CLSI M27-A3.

В системе EUCAST также предложили вариант определения чувствительности дрожжей методом микроразведений в жидкой питательной среде (протокол Edef 7.2 Revision), однако время получения результата составило 24 часа, а не 48 - как у CLSI [75]. На протяжении нескольких лет между двумя центрами CLSI и EUCAST шли дебаты относительно критериев интерпретации минимальных ингибирующих концентраций, и лишь в 2012

году они были гармонизированы [48]. В проведенном в период 2012 – 2013 гг.

исследовании по сравнению результатов, полученных в соотвествии с вышеуказанными протоколами было определено, что общая согласованность составляла от 78,9% (позаконазол) до 99,6% (флуцитозин). Совпадение по категориям чувствительности составило 95% для всех антимикотиков, кроме каспофунгина (84,6%). Наряду с этим была обнаружена низкая согласованность при определении чувствительности C. glabrata к

амфотерицину В, анидулафунгину, у C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei – к

каспофунгину и у большинства видов – к итраконазолу и позаконазолу.

Высокая степень согласованности была обнаружена относительно флуконазола, вориконазола и микафунгина против C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei [126].

С развитием референтных методов стали появляться коммерческие аналоги: ручные тест-системы – MICRONAUT –AM, SensititreYeastOne (Trek Diagnostics), E – test (AB Biodisk), ATB Fungus 2 (bioMerieux) и

автоматические – Vitek (bioMerieux), MicroScan WalkAway (Siemens) для удобства применения в практике.

В исследовании 133 изолятов Candida spp. отмечали, что совпадение между этими системами для флуконазола составляет 82,7%, для триазолов

(72,9 – 77,9%) [28]. При сравнении результатов чувствительности к антимикотикам 170 изолятов C. albicans, полученных тест-системой

37

MICRONAUT – AM с протоколам CLSI A27-A3, EUCAST, было обнаружено,

что все изоляты C. albicans были чувствительны к флуконазолу и вориконазолу в сравнении с CLSI A27–A3, и 2% обладали промежуточной чувствительностью к флуконазолу по сравнению с EUCAST [107].

Многоцентровое исследование по сравнению МПК противогрибковых препаратов изолятов Candida spp., с использованием автоматической системы Vitek2 Compact и референтного метода микроразведений по протоколу CLSI M27–A3, показало, что совпадение между результатами вышеуказанных методов составило 99,5% (n=867) в отношении каспофунгина, 98,6% (n=867) – микафунгина и позаконазола - 95,6% (n=452) [127]. В исследовании, проведенном в Бразилии при сравнении результатов

Vitek2 Compact и CLSI M27-A3, было обнаружено, что совпадение у C. parapsilosis составило 97,5%, C. glabrata - 85,5 % [158].

Таким образом, в начале XXI века остается проблема быстрой, точной идентификации и определения чувствительности к противогрибковым препаратам Candida spp. в клинической микробиологической лаборатории. В

таблице 3 приведена эволюция методов диагностики в микробиологии.

Таблица 3 – Эволюция методов диагностики, применяемых в

микробиологии по Khardori N. [92].

38

Продолжение таблицы 3

В настоящее время перспективным направлением в определении чувствительности к противогрибковым препаратам является устойчивость к ним с помощью молекулярно-биологических методов [31]

Один из них основан на масс-спектрометрии [104]. Этот метод хорошо себя зарекомендовал себя в видовой идентификации грибов, однако применение его для определения устойчивости к антимикотикам, только начинается и пока проведено небольшое количество исследований. Так в работе в серии разведений противогрибкового препарата определяли пороговую концентрацию, при которой меняется белковый профиль микромицета — C. albicans. Оказалось, что минимальная концентрация флуконазола, изменяющая белковый профиль, находится в хорошем соответствии с МПК, определенной по стандартам CLSI. Также при помощи масс-спектрометра возможно непосредственное выявление продуктов распада лекарственного вещества, ферментированного устойчивым штаммом патогенного микроорганизма. Работы в этом направлении были проведены пока только в отношении антибиотиков [104].

Известно, что при помощи масс-спектрометрии находят особенности белковых профилей, свойственные устойчивым штаммам микромицетов

[138]. Такой подход можно назвать типированием. Следует отметить, что по литературным данным, подавляющая часть клинических изолятов вида C. parapsilosis sensu lato является чувствительной к противогрибковым препаратам: флуконазолу, миконазолу, итраконазолу и нистатину [38],

флуконазолу и вориконазолу [25].

39

Методы, основанные на масс-спектрометрии, позволяют получить результат за непродолжительное время — три часа по оценкам Постераро с соавторами [23].

Также их несомненным достоинством является возможность одновременного определения видовой принадлежности возбудителя и его лекарственной устойчивости. Несмотря на это, разработка методов определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, основанных на масс-спектрометрии, в частности, в отношении грибов рода Candida, ещё не завершена [139].

Ещё одним новшеством, которое появилось сравнительно недавно,

стали методы определения чувствительности к противогрибковым препаратам, основанные на изучении геномных последовательностей. Здесь функциональный подход связан с изучением путей воздействия противогрибковых препаратов на клетку и механизмов устойчивости к ним.

В настоящее время значительная часть фундаментальных разработок в этой области относится к изучению полиморфизма генов, кодирующих белки-

мишени лекарств и трансмембранные переносчики [55].

Существует несколько механизмов, по которым грибы вырабатывают устойчивость к действию лекарственных препаратов группы азолов. Во-

первых, это пути, связанные с индукцией мембранных переносчиков семейств ABC (ATP-binding cassette) и MFS (Major Facilitator Superfamily). На первой стадии развития устойчивости соответствующие транскрипционные факторы связываются с промоторами генов этих белков, что приводит к повышению их экспрессии, увеличении числа переносчиков в клеточной мембране, и ускоренному выводу лекарственных веществ из цитоплазмы клеток гриба. С увеличением времени воздействия антимикотика гены транскрипционных факторов приобретают ряд мутаций. Аминокислотная последовательность транскрипционных факторов меняется таким образом,

что они становятся постоянно связанными с промоторами генов мембранных переносчиков [145]. Во-вторых, за приобретение микромицетами

40

устойчивости к воздействию азолов отвечают механизмы, ассоциированные с ферментом CYP51. Ген CYP51 приобретает мутации. Аминокислотные замены в цитохроме ухудшают связывание с молекулами лекарственного препарата, активность же фермента меняется незначительно, что позволяет грибу в присутствии молекул лекарства в цитоплазме поддерживать приемлемую концентрацию эргостерола на мембране. Различные мутации в гене CYP51 могут быть коррелировать с развитием устойчивости к различным соединениям азольного ряда [146]. Также существуют изменения в транскрипционной регуляции экспрессии гена цитохрома, по подобию тех,

которые были упомянуты для мембранных насосов. Они приводят к увеличению количества цитохрома на мембране клеток гриба и к повышению эффективной дозы лекарства. Интересно, что приобретение гиперактивного аллеля транскрипционного фактора белка CYP51 связано со снижением общей жизнеспособности и вирулентности патогена [57].

Эффекты мутаций, приводящих к изменению восприимчивости гриба к препарату азольного ряда и выраженные в МИК, арифметически суммируются [80]. Ещё один, менее распространённый у грибов рода

Candida механизм устойчивости связан с мутационной инактивацией фермента Erg3: нарушение работы CYP51 не вызывает накопления токсичного стерола [19].

Мишенью препаратов эхинокандинового ряда так же, как и азолов,

является поверхность клетки. Однако в случае с эхинокандинами это не липидный, а полисахаридный компонент. Эхинокандины ингибируют 1,3-β- D-глюкан-синтазу. Это приводит к нарушению структуры клеточной стенки и лизису дрожжей и аберрантному гифальному росту у плесеней.

Устойчивость грибов рода Candida к эхинокандинам обусловливается мутациями в гене, кодирующем элементы 1,3-β-D-глюкан-синтазного комплекса. Эти мутации приводят к значительному повышению МПК по сравнению с изолятами дикого типа. Мутации в гене 1,3-β-D-глюкан-синтазы