4 курс / Дерматовенерология / Диссертация_Рауш_Е_Р_Особенности_возбудителей_внутрибольничного

111

представителями других видов Candida. Данным методом также была уточнена видовая принадлежность у штаммов неидентифицированных тест-

системой AUXACOLOR 2 – C. utilis и C. lusitaniae. Состав C. не-albicans

видов в нашем исследовании был представлен следующими патогенами:

20,2% – C. parapsilosis, 11,5% – C. glabrata, 9,6% – C. tropicalis, 6,2% – C. krusei, 5,3% – C. guilliermondii, 4% – остальные редкие виды (С. bracarensis,

C. kefyr, C. utilis, C. lipolityca. C. inconspicua, C. dubliniensis, C. lusitaniae).

Всего было определено 14 видов возбудителей ВБИК. Выявленное нами соотношение видов C. albicans / C. не-albicans (43,2%/56,8%) в структуре возбудителей ИК, выделенных их всех в норме стерильных биосубстратов,

совпадает с рядом зарубежных исследований, которые были проведены ранее или одновременно с нашей работой. В глобальном исследовании SENTRY

(79 центров из 4 регионов мира), проведенном в период 2008-2009 гг. при изучении этиологии внутрибольничного инвазивного кандидоза, отмечено,

что в спектре видов Candida spp. доля C. albicans составила 48,4%, а C. не- albicans – 51,6% [33]. Сообщается, что в Испании, выявлено аналогичное соотношение: процент штаммов C. albicans был равен 45,4, C. не-albicans -

54,6. Помимо этого, было отмечено сходство и среди C. не-albicans видов;

как и в России, лидирующую позицию в Испании занимала C. parapsilosis –

24,9%, далее следовали 13,4% - C. glabrata и 7,7% - C. tropicalis [65].

Из крови в нашем исследовании было выделено 14 видов Candida spp.,

где содержание C. albicans составляло 38,8%, C. не-albicans виды – 61,2%, в

том числе и редкие виды. В других стерильных биосубстратах, в среднем,

было обнаружено от 2 до 5 видов Candida spp., причем преобладал C. albicans (р<0.05). По результатам международного исследования PATH доля

C. albicans в крови составила 42,1%, видовой спектр был представлен 10

видами [66]. В Бельгии (2010 – 2012 гг.) в рамках отдельного госпиталя выявлено стабильное соотношение возбудителей ИК C. albicans / C. не- albicans видам как 37% / 63% [152].

112

Таким образом, мы, наравне с рядом зарубежных исследователей выявили тенденцию к снижению встречаемости C. albicans вида и увеличения распространенности C. не-albicans видов как возбудителей инвазивного кандидоза.

Нами проанализированы изменения видового состава возбудителей ВБИК на протяжении трех лет исследования. Выявлено, что имеется снижение доли C. albicans среди возбудителей ВБИК. Наряду с этим, имело место возрастание C. не-albicans видов, причем за счет C. parapsilosis (20,2%),

тогда как уровень C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei (8,2%, 8,2% и 6,1%)

оставался стабильным. По данным испанских ученых, в 2009 году в Испании,

уровень вида C. albicans составлял 43%, C. parapsilosis – 29 %, а C. tropicalis

– 10% [131]. В аналогичный период в Бразилии процентное соотношение видов было иное: C. albicans – 41%, C. tropicalis – 20 %, C. parapsilosis – 15%,

а в Тайланде: C. albicans – 39%, C. tropicalis – 28%, C. glabrata – 22% [151]. В

Греции доля C. parapsilosis составила 43,9 % (с 2007 – 2012 г.) [87]. В США в

2012 г. напротив на втором месте находилась C. glabrata – 29%, также как и в Дании и Норвегии, где доля C. glabrata составляет 21,1% и 20,3%

соответственно [88].

Нами была выявлена географическая вариабельность видового состава возбудителей ВБИК в разных федеральных округах России. Доля C. albicans

в Уральском (57,8%) и Сибирском (75%) федеральных округах в структуре возбудителей ИК была достоверно выше, чем в Южном (36%) и Северо-

Западном (37%) федеральных округах (р < 0.05). По результатам нашего исследования было выявлено, что доли C. albicans в структуре возбудителей ИК в Иркутске и Ростове на Дону, достоверно выше были в Иркутске, тогда как между крупными городами (Санкт-Петербург и Москва) достоверных различий в видовом спектре возбудителей ИК не выявлено.

В период 2003 – 2008 гг. в рамках международного проспективного исследования ARTEMIS DISK (127 центров, 39 стран) C. albicans была причиной кандидемии в 62% случаев, по сравнению с периодом в 1997 по

113

1998 гг. доля C. albicans была выше, 73,3% [143]. В Дании в период с 2005 по

2011 гг. отмечали снижение доли C. albicans в структуре кандидемии с

69,8 % до 63% [115, 147]. В США с 1999 по 2012 гг. обнаружили значительное снижение уровня C. albicans с 52% до 38% [86, 149, 155], в

Испании с 2005 по 2013 гг. доля C. albicans снизилась с 51% до 45,4 % [82].

Различия в этиологии ВБИК могут быть обусловлены рядом факторов:

географией региона, типом стационара, фоновыми заболеваниями, спектром противогрибковых препаратов и выбранным методом идентификации возбудителей [37].

Следует заметить, что обсуждаемые выше результаты получены различными методами идентификации возбудителей ВБИК. При этом методы молекулярной биологии (MALDI-TOF масс-спектрометрия, ДНК-

секвенирование) использовали редко. Учитывая, что референтный метод идентификации грибов (ДНК-секвенирование) является трудоемким,

длительным по времени, дорогостоящим, в отличие от MALDI-TOF масс-

спектрометрии, сегодня, представляется нецелесообразным рекомендовать его для применения в повседневную микробиологическую практику (таблица

25).

Таблица 25 – Краткая характеристика используемых методов диагностики.

Представителей всех обнаруженных видов Candida spp. (C. albicans, C. parapsilosis, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii, С. bracarensis, C. kefyr, C. utilis, C. lipolityca, C. inconspicua, C. dubliniensis, C. pararugosa, C. lusitaniae) помимо биохимических характеристик изучили

114

микро - и макроскопически. Обнаружено, что микро- и

макроморфологические характеристики совпали с приведенными в определителях [29, 95]. Однако следует заметить, что некоторые виды имели сходные характеристики и по морфологии и по биохимическим свойствам, в

связи, с чем их можно было идентифицировать с ошибкой. Поэтому мы уточняли видовую идентификацию методом MALDI-TOF масс-

спектрометрии. И следовательно в любой лаборатории только фенотипический метод видовой идентификации возбудителей ВБИК нельзя считать достаточным.

Кроме определения видов возбудителей ВБИК, важным является выяснение чувствительности штаммов возбудителей к антимикотическим препаратам, так как в последние годы все чаще сообщают о снижении чувствительности Candida spp. к флуконазолу. Французскими учеными было обнаружено, что чувствительность к этому антимикотику снизилось на 17%

[72]. По данным глобального исследования ARTEMIS DISK в России (20032008 гг.) чувствительность возбудителей ИК составила 78% [15].

Первые результаты в рамках определения чувствительности возбудителей ИК к противогрибковым препаратам в России были получены в г. Санкт-Петербурге в период 1998 – 2004 гг. Методом CLSI M44-A

определена чувствительность к флуконазолу у 50 штаммов Candida spp. Было обнаружено, что чувствительными были 58% изолятов, а 42% обладали сниженной чувствительностью (34% были устойчивыми к флуконазолу и 8%

– умеренно-чувствительными) [124].

При проведении нашего исследования мы использовали два референтных метода определения чувствительности грибов к антимикотикам: стандартные – CLSI M27-A3, CLSI M44-A и

микробиологический анализатор Vitek2 Compact. В соответствии с нашими данными, полученными по протоколу CLSI M27-A3, чувствительными к флуконазолу были 74,5% изолятов Candida spp. (n=322), умеренно-

чувствительными - 13,4 % и 12,1% – устойчивыми. При этом, обнаружено

115

что C. albicans в 97,1% случаев были чувствительны к флуконазолу,

умеренно-чувствительны в – 0,7 % и 2,2% – устойчивыми. Таким образом,

вид C. albicans сохраняет высокую чувствительность к флуконазолу. Для C.

не-albicans видов чувствительность к флуконазолу составляет 58%

исследуемых штаммов; умеренно-чувствительными были 23% и 19%

штаммов – устойчивыми.

К вориконазолу чувствительность штаммов Candida spp. составила

97,5%, а доля умеренно-чувствительных и устойчивых составила – 0,9 % и

1,6%, соответственно. При этом 99,7% штаммов C. albicans были чувствительными к вориконазолу, а среди C. не-albicans – 95,7% штаммов,

тогда как доля умеренно-чувствительных к вориконазолу составила 1,6%,

устойчивых – 2,7%. Также было установлено, что 2 штамма C. guilliermondii,

2 штамма C. parapsilosis, 1 штамм C. tropicalis и 1 штамм C. albicans были устойчивы и к флуконазолу, и к вориконазолу. Таким образом, среди штаммов Candida spp. 1,9% были полирезистентны к азоловым антимикотикам. Наряду с этим, при изучении МПК противогрибковых препаратов, МПК50, МПК 90 было выявлено, что к флуконазолу у C. parapsilosis и C. guilliermondii начинает формироваться внутривидовая устойчивость. Такая же тенденция, как и в России была отмечена в исследовании в одном из госпиталей Бразилии в период исследования с 1998

по 2005 г [151]. В других исследованиях среди 1029 изолятов C. guilliermondii (127 медицинских центров) было отмечено снижение чувствительности к флуконазолу – до 25% штаммов [36].

В Турции при проведении исследования (2008 – 2009 гг.) по определению чувствительности возбудителей ВБИК к флуконазолу методом

CLSI M27-A3 установили, что Candida spp. были чувствительными в 81,1%,

умеренно-чувствительными – 8,1 % и 10,8% - устойчивыми. В отношении вориконазола доли умеренно-чувствительных и устойчивых были по 0,9 % [61]. Таким образом, процентное соотношение категорий чувствительности

116

видов Candida spp., полученных нами, совпадает с данными, полученными другими исследователями.

К каспофунгину штаммов со сниженной чувствительностью нами обнаружено не было. При определении чувствительности к позаконазолу мы ориентировались на значение МПК90 > 1 мкг/мл, также как и большинство зарубежных исследователей, В нашем исследовании МПК90 позаконазола составило 0,125 мкг/мл. В исследовании, проведенном в Бразилии, МПК90

позаконазола составляла 0,25 мкг/мл. [43].

При определении чувствительности Candida spp к противогрибковым препаратам диско-диффузионным методом - протокол CLSI M44-A (141

клинический изолят) мы выявили, что 67,4% штаммов были чувствительны к флуконазолу, 32,6% – обладали сниженной чувствительностью. Результаты,

полученные в соответствии с двумя стандартными протоколами (CLSI M27A3, критерии 2012 г. и CLSI M44-A) были сравнимы. Количество чувствительных штаммов C. albicans составило 96,3% и 3,7% - устойчивых к флуконазолу. Среди C. не-albicans видов чувствительными были 48,8 %

(CLSI M27-A3) и 46,6% (CLSI M44-A), умеренно-чувствительными 21,6%

(оба метода), устойчивыми – 29,5% и 27,3%. Чувствительных штаммов C. albicans к вориконазолу было обнаружено 98,1%, а устойчивых – 1,8% по обоим протоколам. Среди C. не-albicans видов чувствительными к вориконазолу было 92% (CLSI M27-A3) и 83% (CLSI M44-A), умеренно-

чувствительных – 2,3% и 9%, устойчивых – 5,7% и 7,9%. Достоверных различий в результатах, полученных двумя методами, не выявлено.

Для определения чувствительности к противогрибковым препаратам использовали также коммерческий метод Vitek2 Compact (82 изолята).

Сопоставимость результатов, полученных с использованием протокола CLSI M27-A3 и метода Vitek2 Compact (по критериям интепретации CLSI M27-A3,

2012 г.) составляла от 78 до 100% в зависимости от вида изолята. Однако при сравнении результатов по критериям CLSI M27-A3, 2008 г. были отмечены несовпадения (12% в отношении флуконазола и 4,8% в отношении

117

вориконазола). В исследовании американских ученых в 2011 г., при сравнении результатов определения чувствительности к каспофунгину и позаконазолу методами CLSI M27-A3 и Vitek2 Compact, обнаружено, что совпадение для каспофунгина составило 99,5%, для позаконазола – 95,6%.

Однако, в зависимости от вида Candida spp. вариации в совпадении по категориям чувствительности составляли от 30% (C. krusei) до 100% (C. guilliermondii, C. parapsilosis) для каспофунгина [108, 109]. Совпадение результатов чувствительности к флуконазолу и вориконазолу методами CLSI M27-A3, Vitek2 Compact, E-test в исследовании французских ученых (2010 г.)

варьировало от 25% до 100% (25% – C. glabrata) [22].

В крупном проспективном исследовании FUNGINOS (Швейцария,

2004-2009 гг.), анализируя 1090 изолятов крови, сравнивали результаты их чувствительности по критериям интерпретации EUCAST и CLSI M27-A3

(2008 и 2012 гг.). Для C. albicans не было выявлено значимых отличий МИК флуконазола, вориконазола и каспофунгина, 98% штаммов были чувствительны. Среди C. не-albicans наблюдали возрастание устойчивых изолятов среди C. tropicalis и C. parapsilosis для азолов, а также C. glabrata и C. krusei для каспофунгина в соответствии с новыми критериями EUCAST и CLSI 2012 г. по сравнению с критериями CLSI 2008 г. [40].

Следовательно, на основании наших исследований можно заключить,

что в качестве метода выбора определения чувствительности к противогрибковым препаратам возбудителей ВБИК в микробиологической практике можно рекомендовать диско-диффузионный метод (протокол M44- A) и микробиологический анализатор Vitek2 Compact с критериями CLSI M27-A3 (2012 г). Метод разведения в жидких питательных средах (протокол

CLSI M27-A3), в связи с его трудоемкостью, можно рекомендовать к использованию в основном в референтных лабораториях.

Учитывая возрастающее значение комплекса видов C. parapsilosis при инвазивном кандидозе мы проанализировали 65 масс-спектро-профилей этого комплекса. Были выявлены только штаммы, принадлежащие к виду C.

118

parapsilosis sensu stricto, криптические виды C. metapsilosis, C. orthopsilosis

не были обнаружены. Однако, в зарубежных исследованиях отмечают обнаружение и криптических видов комплекса C. parapsilosis – C. orthopsilosis, C. metapsilosis как методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, так и рефентным методом (ДНК-секвенирование). В Италии при сравнительном исследовании комплекса C. parapsilosis, в который входят такие виды как C. metapsilosis, C. orthopsilosis и собственно C. parapsilosis,

методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и AFLP (молекулярно-

генетический метод) были выявлены все виды с высокой степенью точности, входящие в комплекс.

Путем проведения кластерного анализа нами выявлены сходные штаммы от разных пациентов – изоляты №№ 29, 30, 31 – г. Москва , №№ 14,

15 – г. Тюмень, №№ 24, 42 – г. Санкт-Петербург (в одном отделении и в один промежуток времени). Также выявлено, что в субкластере № 2

располагаются устойчивые к флуконазолу изоляты №№ 21 и 39, а в субкластере №3 находятся изоляты №№ 24 и 41, обладавшие устойчивостью также и к вориконазолу (изолят № 41).

Следует заметить, что поскольку среди исследуемых штаммов C. parapsilosis были выявлены сходные масс-спектры штаммов, к тому же имевшие устойчивость к азоловым препаратам в одном и том же субкластере, мы использовали ДНК – секвенирование в качестве метода поиска полиморфизма у данных устойчивых штаммов. Полиморфизм в регионе

D1/D2 гена 28S рРНК, в том числе и множественный, был выявлен у чувствительных к флуконазолу и вориконазолу штаммах C. parapsilosis, у

устойчивых штаммов полиморфизма не наблюдали. Следовательно, изучение в дальнейшем полиморфных вариантов генов Candida spp. будет перспективным при разработке быстрых методов определения устойчивости возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза к противогрибковым препаратам.

119

ВЫВОДЫ

1.Этиология внутрибольничного инвазивного кандидоза в РФ (2011–

2014 гг.) представлена следующими основными видами Candida (C. albicans – 43,2%, C. parapsilosis – 20,2%, C. glabrata – 11,5%, C. tropicalis – 9,6%, C. krusei – 6,2%, C. guilliermondii – 5,3%) и редкими

(C. lusitaniae – 1,3%, C. dubliniensis – 0,6%, C. pararugosa – 0,6%, C. bracarensis – 0,3%, C. kefyr – 0,3%, C. lipolytica – 0,3%, C. utilis – 0,3%,

C. inconspicua – 0,3%).

2.Установлено, что в этиологической структуре основных возбудителей инвазивного кандидоза возросла доля C. не-albicans (с 46% в 2012 г. до

67,2% в 2014 г.), при этом увеличилась доля C. parapsilosis (9,8% в

2012 г. против 27,8% в 2014 г., р <0,05). Уровень C. albicans достоверно выше в Сибирском (75%) и Уральском (57,8%) федеральных округах,

р<0,05, по сравнению с другими федеральными округами (Северо-

Западный – 37%, Южный – 35%).

3.MALDI-TOF масс-спектрометрия является методом выбора для определения вида возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза.

4.Чувствительными к флуконазолу были 97% штаммов C. albicans, к

вориконазолу - 99,7%. Среди штаммов C. не-albicans видов чувствительными к флуконазолу были 58%, к вориконазолу – 95,7 %. К

каспофунгину устойчивых штаммов не обнаружено.

5.Диско-диффузионный метод CLSI M44-A является методом выбора для определения чувствительности возбудителей инвазивного кандидоза к противогрибковым препаратам в практике микробиологических лабораторий.