4 курс / Дерматовенерология / Диссертация_Рауш_Е_Р_Особенности_возбудителей_внутрибольничного

21

среди C. не-albicans второе место занимала C. glabrata - 15,3%, далее C. parapsilosis – 8,5%, C. tropicalis – 8,0%, C. krusei – 3,4% [26].

Таким образом, можно заключить, что этиология ИК в различных географических регионах не однородна. В последние десятилетия в большинстве стран мира наблюдается изменение видового спектра возбудителей ИК с увеличением распространенности C. не-albicans видов.

1.3 Современные подходы к видовой идентификации возбудителей

инвазивного кандидоза

Подтверждение диагноза ИК в России базируется на следующих критериях диагностики: получение роста Candida spp. при посеве крови и других в норме стерильных биосубстратов, биопсийного материала от пациента с клиническими признаками инфекции, а также при обнаружении

Candida spp. при гистологическом исследовании глубоких тканей. Для получения культуры возбудителя ИК забор крови производят у пациентов с температурой более 380С или другими признаками генерализованной вопалительной реакции 2 раза в день в течение не менее 3 дней,

серологические тесты не рекомендованы. Посев производят на жидкие питательные среды (бульон Сабуро, сусло) [4]. В соответствии с Европейскими рекомендациями по диагностике кандидоза (2012г.), забор крови производится ежедневно трехкратно из каждой локтевой вены с интервалом 30 минут, посев осуществляют во флаконы систем BacT/ALERT

и других (для аэробных и анаэробных культур) с инкубацией не менее 5

суток [63], что позволяет определить наличие или отсутствие Candida spp. в

крови [37].

Другие стерильные в норме биоматериалы засевают также на плотные питательные среды. Для этого в большинстве лабораторий используют агар Сабуро, сусло – агар. Применение хромогенных сред – питательных сред с субстратом, который, взаимодействуя с ферментами различных видов

Candida, окрашивают их колонии в определенные цвета (CHROMAgar

22

Candida, BD Diagnostic) [136], помогает выявить разные виды Candida в

смешанной культуре, однако точно идентифицировать вид Candida не позволяет [5, 21].

При выделении культуры микромицета для видовой идентификации в настоящее время в практике используют различные коммерческие методы,

например тест-системы Remel BactiCard Candida Kit (Thermo Scientific™,

США). При чувствительности и специфичности данной тест-системы –

98,7 % и 99,6% соответственно, за 5 минут данный тест позволяет дифференцировать вид C. albicans от других видов Candida [54]. Тест на образование «ростковых» трубок также позволяет отличить C. albicans, C. dubliniensis, образующих ростковые трубки в сыворотке крови, от других видов.

Таким образом, заметим, что данных методов идентификации вида недостаточно, поскольку они расчитаны в основном на дифференцировку C. albicans от C. не-albicans видов. Более предпочтительны методы видовой идентификации, ориентированные на определение биохимических свойств,

молекулярно-генетических особенностей и белкового масс-спектра профиля микромицета (рисунок 3).

23

Идентификация

грибов

Рисунок 3 – Развитие методов видовой идентификации грибов рода Candida spp.

Методы видовой идентификации, основанные на изучении молекулярно-генетических особенностей, стали применяться сравнительно недавно, а протеомные технологии – начиная с 2000-х годов [60].

Одним из давно разработанных методов идентификации является определение видов Candida по биохимическим свойствам микромицета. Для определения ферментации углеводов раньше использовали жидкие питательные среды с углеводами, реактивом Андреде и стеклянными поплавками. Ассимиляцию углеводов проводили методом дисков, т.е.

24

использовали бумажные диски с нанесенными на них растворами углеводов

[14]. За последние десятилетия появились промышленно приготовленные

тест – системы как для ручной постановки теста, так и для автоматической. К

числу «ручных» тест-систем относятся RapID Yeast Plus (Remel), API ID32C,

AUXACOLOR2 (BioRad) и другие. Подобные тест-системы просты в использовании и обладают высоким процентом сопоставимости результатов с референтными молекулярно-биологическими методами. Так, в

сравнительном исследовании трех биохимических тест-систем (Candifast,

API 20C AUX, Fungichrom) с использованием 116 клинических изолятов,

процент правильной идентификации составил 82,7 – 95,6, время определения

видов составило от 24 до 48 часов [81].

Среди автоматических анализаторов наиболее часто используют Vitek2

Compact (bioMerieux) с картами VITEK2 YST, с их помощью в исследовании

проведенном в Италии верно идентифицировали 98,2% из 750 клинических

изолятов дрожжей, предварительно прошедших ДНК-секвенирование [76].

Также автоматическими анализаторами являются MicroScan plus WalkAway

(Siemens), Phoenix (Becton Dickinson). Выявлено, что совпадение между

результатами идентификации MicroScan plus WalkAway и VITEK2 YST

составляет 94% [140]. При простой пробоподготовке и высокой

сопоставимости результатов с результатами референтного метода (ДНК-

секвенирование), длительность инкубации составляет до 18 часов, для

анализатора MicroScan plus WalkAway – 4 часа.

Во многих странах проводили сравнительные исследования эффективности биохимических методов идентификации. Так, сравнение тест-

систем API ID32C, AUXACOLOR2 и Vitek2 Compact в рамках исследования в отделениях реанимации и интенсивной терапии в Греции в период с 2005 по 2010 гг. выявило, что из 253 изолятов с помощью Vitek2 Compact верно идентифицировано 84%, API ID32C – 83%, AUXACOLOR2 – 80%. Так, среди наиболее часто встречающихся видов, таких как C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis процент верно идентифицированных штаммов был выше

(AUXACOLOR2 – 94,5%, API ID32C – 94%, Vitek2 Compact – 91%), чем в

25

отношении редких видов (AUXACOLOR2 -74%, API ID32C – 75%, Vitek2 Compact – 82%) [87]. С помощью трех систем точно идентифицировали более 91% часто встречающихся изолятов, и эти системы могут быть применены в рутинной практике; для редких видов рекомендовано применение молекулярно-генетических методов. В исследовании, проведенном в Бразилии, при сравнении результатов Vitek2 Compact и API ID20C AUX было обнаружено, что совпадение составляет 93,6 % [158].

Таким образом, основным недостатком методов видовой идентификации возбудителей ВБИК по биохимическим свойствам является длительность идентификации (18 – 48 часов), а также невысокий процент правильной идентификации редких видов.

Молекулярно-генетические методы направлены на определение количественных и качественных характеристик первичной структуры ДНК. В настоящее время разработаны и широко применяются различные методы молекулярной генетики общим числом около ста. Основу подавляющего большинства таких методов составляет полимеразная цепная реакиця (ПЦР). Перечень наиболее часто используемых методов приведен в таблице 1[1].

Таблица 1 – Наиболее распространенные молекулярно-генетические методы

26

В зависимости от целей исследования все молекулярно-генетические методы можно подразделить на две группы: методы, направленные на определение структуры ДНК (видовая идентификация, поиск новых мутаций), и на анализ известных генетических последовательностей (полиморфных вариантов генов или идентификация микроорганизмов по референтной последовательности ДНК).

Исторически первым методом идентификации генетических последовательностей стал метод блот-гибридизации (Саузерн-блот),

предложенный еще в 1975 году английским ученым Эдвардом Саузерном. С

открытием термостабильной полимеразы, в практику молекулярных генетиков вошел метод ПЦР, произведший переворот в генетических исследованиях. Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка нуклеиновой кислоты ДНК с помощью ферментов in vitro. Копирование происходит только того участка, что удовлетворяет заданным условиям и если он присутствует в исследуемом образце. В

отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликация), с

помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК.

Метод ПЦР лежит в основе всех методов, применяемых для диагностики и идентификации микромицетов в клинической практике [1].

В настоящее время референтным методом определения видовой принадлежности микромицетов является протокол M18-А Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), по которому идентификацию грибов необходимо проводить с применением ПЦР, с

последующим секвенированием генов мишеней, которые имеют достаточно разнородный нуклеотидный состав, с высокой межвидовой дивергенцией.

Идентификация устанавливается путем выравнивания анализируемой нуклеотидной последовательности с последовательностями, представлен-

ными в GenBank или в других базах данных генетической информации.

Общие положения данного подхода для молекулярной биологии предложены Д. Сэмбруком и Д. Расселом в 2001 году (Sambrook & Russell) [141].

27

GenBank является базой данных всех аннотированных нуклеотидных

(ДНК и РНК) и аминокислотных последовательностей, которые они кодируют, представленных в свободном доступе для исследователей всего мира. Эту базу данных поддерживает Американская Национальная библиотека медицины Национального центра биотехнологической информации (NCBI). GenBank коллаборирует с другими информационными банками, такими как Европейская молекулярно-биологическая лаборатория

(EMBL) и Банк данных ДНК Японии (DDBJ), осуществляют регулярный обмен данными между этими тремя архивами аннотированных нуклеотидных последовательностей [141].

Для видовой идентификации микромицетов выбран комплекс рибосомальных генов (рисунок 4), содержащих высоко консервативные домены, перемежающиеся с более вариабельными областями, которые содержат видоспецифические «подписи». Для упрощения субъединицы этого комплекса называют рДНК, подразумевая, что это гены, кодирующие рРНК молекулы.

Рисунок 4 – Организация рРНК генов микромицетов Внутри рДНК комплекса существует совокупность множества

тандемных повторов нуклеотидов, находящихся по направлению от 5` к 3`

концу между субъединицами 18S и 5.8S, а также 5.8S и 28S, называющихся вариабельными внутренними транскрибируемыми спейсерами (ITS),

соответственно 1 и 2. Фланкируют ген большой рибосомальной субъединицы

28S два вариабельных нетранскрибируемых спейсер региона: IGS1-5S-IGS2.

УSaccharomyces cerevisiae существует приблизительно 140 единиц повторов.

Упредшественника транскрипта РНК происходит ферментативное удаление

ITS регионов, и, после дальнейших модификаций, формируются 18S, 5.8S и

28S зрелые рРНК, которые в комбинации с белками формируют

28

функциональные рибосомы. Биологическая роль ITS регионов - участие в ранней транскрипции РНК процессинга. Таким образом, они являются некодирующими регионами генома [141].

ITS1 и ITS2 регионы, фланкирующие 5.8S рДНК ген, показывают значимую нуклеотидную дивергенцию. Каждый ITS регион около 300 пар нуклеотидов в длину. Они очень хорошо подходят для видовой идентификации как дрожжей, так и нитчатых грибов (таблица 2) [90].

Тринадцать известных патогенов, включая потенциально инвазивные виды

Aspergillus, можно идентифицировать путем сравнительного анализа их ITS1

и ITS2 последовательностей. При использовании двух спейсерных регионов достигается лучшая межвидовая дифференциация, чем при использовании одного региона.

Таблица 2 – Видовая идентификация путем прямого анализа региона внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) рДНК [90].

Также для видовой идентификации дрожжей используют вариабельный регион (первые, приблизительно 600 пар нуклеотидов) большой

29

субъединицы РНК 28S (иногда в литературе описывается, как 26S),

названный D1/D2 субрегионом, тогда как остальная последовательность 28S

высоко консервативна [95]. Последовательности D1/D2 всех видов дрожжей аскомицетов и базидиомицетов известны и представлены в GenBank.

Большинство видов дрожжей может быть идентифицировано по их различиям в нуклеотидной последовательности D1/D2 домена. Для восьми видов Candida spp. разработан метод быстрой диагностики с использованием микросфер, с нанесенными нуклеотидными последовательностями D1/D2,

для проточной цитометрии [145].

Метод ДНК-секвенирования не зря признан «золотым стандартом» для видовой идентификации микромицетов. По современным данным, видовая идентификация по ITS региону клинических изолятов дрожжей (включая виды Candida) в 99,7% случаев корректна, даже для редких видов [35]. По нашим данным, согласие между результатами молекулярно-генетической и классической фенотипической идентификаций варьирует между исследованиями довольно значительно, в пользу ДНК секвенирования [4].

В настоящее время ДНК-секвенирование используют не только для определения вида внутри рода, но и для типирования внутри вида. Подобное внутривидовое типирование позволяет осуществить подход мультилокусного сиквенс-типирования (MLST), который позволяет изучать, как историческое развитие геномной последовательности, так и приобретенные наследственные характеристики (различные перестройки генома,

приводящие к различным фенотипическим вариантам как приобретение резистентных свойств к антимикотической терапии). В исследовании Якобсена и соавторов [80] был проведен анализ изолятов C. albicans MLST,

охватывающий семь регионов различных генов. Показано, что между различными сиквенс-типами существует значимая корреляция с географическим нахождением. Данные исследования позволяют определять схемы миграции клинически важных штаммов, и предсказывать эпидемиологические вспышки.

30

Одним из новых быстрых методов видовой идентификации грибов является технология MALDI-TOF масс-спектрометрии (матрично-

ассоциированная лазерная десорбция/ ионизация время-пролетная масс-

спектрометрия, от англ. MALDI-TOF MS – Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time-of-Flight Mass-spectrometry) – метод видовой идентификации микроорганизмов, основанный на анализе их белкового масс-

спектро-профиля [132]. Технология MALDI-TOF масс-спектрометрии была разработана еще в середине 80-х годов учеными К. Танака, Ф. Гилленкампом,

М. Карасом и использовалась для изучения строения различных высокомолекулярных соединений, в том числе биологического происхождения [102]. Лишь в начале XXI века метод впервые был применен для видовой идентификации патогенных грибов [101], несколько позже для

Candida spp. [102].

В2008 – 2009 гг. в Германии было проведено сравнительное исследование результатов видовой идентификации Candida spp., полученных методами AUXACOLOR2 и MALDI-TOF масс-спектрометрии, в сравнении с референтным молекулярно-генетическим методом. Обнаружено, что методом MALDI-TOF масс – спектрометрии правильно было идентифицировано 97,6%, а методом AUXACOLOR2 – 96,9% [138]. При этом AUXACOLOR2 не смог выявить виды, входящие в комплекс C. parapsilosis, а изолят C. bracarensis был определен как C. glabrata.

В2012 году в Италии было проведено исследование по оценке возможности с помощью метода MALDI-TOF масс-спектрометрии определять Candida spp. непосредственно в положительных посевах образцов крови (BC Bactec Mycosis, Becton Dickinson, BD). Полученные данные сопоставляли с результатами видовой идентификации культур Candida из крови, выделенных на плотных питательных средах. Обнаружено, что C. albicans в посевах крови непосредственно в жидкой среде определена в

95,9% образцов, C. не-albicans виды – в 86,5%. Среднее время проведения