4 курс / Дерматовенерология / Диссертация_Рауш_Е_Р_Особенности_возбудителей_внутрибольничного

101

Среди 141 штамма Candida spp. чувствительными к вориконазолу были

90,0%, сниженной чувствительностью обладали 10%. Штаммы C. albicans

были чувствительны к вориконазолу. Среди 34 штаммов C. parapsilosis

сниженная чувствительность была отмечена у 17,6% (6) культур.

При сравнении результатов определения чувствительности к флуконазолу и вориконазолу по протоколам CLSI M27-A3 и CLSI M44-A

были получены следующие данные (рисунок 42 а, 42 б).

102

Таким образом, достоверных различий между результатами обоих методов не выявлено (p >0,05).

Однако, несмотря на простоту использования метода CLSI M44-A, во многих лабораториях используют автоматические анализаторы, поэтому для сравнения результатов определения чувствительности к азолам у изолятов

Candida spp., полученных стандартными методами, мы использовали автоматический анализатор Vitek 2 Compact.

4.3 Результаты определения чувствительности возбудителей

инвазивного кандидоза с помощью анализатора Vitek2 Compact

Оценку результатов исследования проводили в соответствие с критериями интерпретации референтного протокола CLSI M27-S4 (2012 г.).

В период 2011 – 2014 гг. было исследовано 82 штамма Candida spp.

При определении чувствительности к флуконазолу среди исследованных 82

штаммов Candida spp. установлено, что к категории «чувствительные» относятся 66 (80,4%) штаммов, к категории «устойчивые» – 16 (19,5%) и 7 (8,5%) – к категории с «промежуточной чувствительностью».

При определении чувствительности к вориконазолу к категории

«чувствительные» отнесли 74 (90,2%) штаммов Candida spp., к категории

«устойчивые» – 4 (4,8%) и 4 (4,8%) к категории с промежуточной чувствительностью (таблица 22).

103

Таблица 22 – Сравнение результатов МИК флуконазола и вориконазола, полученных с помощью Vitek2 Compact и методом микроразведений по протоколу

CLSI M27 – А3 (n=82)

104

Продолжение таблицы 22

* – CLSI M27-S3

Сравнением результатов, полученных с помощью методов микроразведений по протоколу CLSI M27-A3 и Vitek 2Compact (таблица 22),

показано, что большинство исследованых изолятов в отношении флуконазола обладали сниженной чувствительностью и демонстрировали МПК90 – 32 мкг/мл и 64 мкг/мл для Vitek 2 и CLSI M27-A3, соотвественно.

Значения МПК вориконазола для данных методов составили соотвественно, 0,25 мкг/мл и 0,5 мкг/мл. Также было отмечено несовпадение результатов

105

определения чувствительности к флуконазолу в отношении штаммов редких

видов – C. utilis и C. inconspicua.

Поскольку оценку результатов Vitek 2 проводят по критериям интепретации

протоколов CLSI M27–S3 и CLSI M27–S4, мы выяснили насколько важно

своевременное обновление критериев, заложенных в приборе (таблица 23,

24).

Таблица 23 – Сравнение критериев интерпретации CLSI M27 S3 (2008г.) и CLSI M27 S4 (2012г.) для МПК флуконазола (Vitek 2)

Таким образом, в соответствиии с критериями 2008 года, при

определении чувствительности к флуконазолу среди исследованных 82

106

штаммов Candida spp., установлено, что к категории «чувствительные» относятся 67 (81,8%) штаммов, к категории «устойчивые» – 12 (14,6%) и 3

(3,6%) – к категории с «промежуточной чувствительностью». Отмечено, что процент несовпадения между критериями 2008 и 2012гг. составил 16% (11/66).

Таблица 24 – Сравнение критериев интерпритации CLSI M27 S3 (2008г.) и

CLSI M27 S4 (2012г.) для МПК вориконазола

При определении чувствительности к вориконазолу, к категории

«чувствительные» отнесли 79 (96,3%) штаммов Candida spp. и 3 (3,7%) - к

категории «устойчивые» (по критериям 2008 года). С связи с тем, что у некоторых видов критерии чувствительности не установлены к вориконазолу,

различия между критериями 2008 и 2012 гг. составил 6,6% (4/60).

107

Таким образом, определение чувствительности и выбор соответствующего метода имеют важное клиническое значение, так как,

результаты определения чувствительности возбудителей ИК диско-

диффузионным методом (CLSI M44 – A) и с помощью автоматического анализатора Vitek2Compact (в соответствии с новыми критериями интерпретации) были достоверно сопоставимы с референтным методом разведений в жидких питательных средах (CLSI M27 – A3), что позволяет рекомендовать оба метода для применения в рутинной клинической практике,

CLSI M44 – A – в качестве основного, в связи с тем, что он также является стандартным методом как и CLSI M27 – A3, а автоматический анализатор

Vitek2Compact - в качестве альтернативного метода.

108

ГЛАВА 5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основными возбудителями инвазивного кандидоза (ИК) являются C. albicans, C. parasilosis, C. glabrata, C. tropicalis и C. krusei, реже другие виды.

В последнее десятилетие установлено, что по уровню заболеваемости

(200000 пациентов ежегодно) в мире инвазивный кандидоз занимает второе место среди микозов и, несмотря на применение современных противогрибковых препаратов, характеризуется стабильно высокой летальностью 46 –75% [156]. В связи с тем, что до 50 - 75 % посевов крови от больных ИК являются отрицательными, а методы идентификации Candida spp. позволяют получить результат только через 48 часов и более, проблема видовой идентификации и выбора ее методов представляется актуальной [88].

С учетом нарастания резистентности микромицетов к противогрибковым препаратам не менее серьезной проблемой явлется определение чувствительности к противогрибковым препаратам, а также выбор соответствующих методов [23]. В связи с этим, представляется актуальным изучение этиологии внутрибольничного инвазивного кандидоза и чувствительности возбудителей к антимикотикам на территории России с использованием современных методов диагностики.

В проведенном нами многоцентровом исследовании, посвященном изучению особенностей возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза в период 2011–2014 гг. в России, впервые изучена этиология ВБИК с применением современных методов видовой идентификации грибов

(MALDI-TOF масс-спектрометрии и ДНК-секвенирования). Изучены 322

клинических изолята Candida spp., выделенных от 258 пациентов из 37

стационаров в 12 городах России (6 Федеральных округов).

Исследование типов биоматериала (кровь и другие в норме стерильных биосубстраты), было обнаружено, что в 83,2% случаев изоляты Candida spp.

были выделены из крови, в 7,5% – из перитонеальной жидкости. Зарубежные исследователи также отмечали, что изоляты Candida spp. из стерильных в

109

норме биосубстратов при ВБИК, чаще всего выделяются из крови [58]. Так, в

многоцентровом исследовании SENTRY (2008-2009 гг.) 65% штаммов (2085

исследуемых культур Candida spp.) были выделены из крови [159].

Некоторые исследователи также отмечали, что Candida spp. высевали из крови в два раза чаще, чем из перитонеальной жидкости, в отделениях реанимации и интенсивной терапии [26].

Видовую идентификацию исследуемых штаммов Candida spp. ранее в мире проводили в основном с использованием морфологических и биохимических методов.

Так, в исследовании, проведенном более 10 лет назад в РФ [9] при видовой идентификации этиологии инвазивного кандидоза в ОРИТ г. Санкт-

Петербурга (1998-2003 гг.) с использованием морфологических и биохимических методов (тест на ростковые трубки, тест-системы

Fongiscreen, AUXACOLOR, API 20C AUX) было выделено 117 штаммов

Candida spp., при этом неидентифицировано до вида было 8,5% изолятов.

Однако, в последние годы молекулярно-биологические методы (ДНК-

секвенирование, MALDI-TOF масс-спектрометрия) тоже начали внедрять в практику микробиологических лабораторий.

Определение видового спектра возбудителей ВБИК в нашем исследовании проведено методами ДНК-секвенирования, MALDI-TOF масс-

спектрометрии и тест-системой AUXACOLOR2. ДНК-секвенирование является рефентным методом видовой идентификации микроорганизмов; и MALDI-TOF масс-спектрометрия, по данным ряда исследователей, также является методом, приближенным по точности к референтному, но превосходит по быстроте идентификации. Однако, сравнительных исследований такого рода проведено относительно мало и на ограниченном количестве штаммов.

Результаты идентификации изолятов Candida spp. (97 штаммов) в

нашем исследовании, полученные двумя методами (ДНК-секвенирование и

MALDI-TOF масс-спектрометрия) совпали в 100% случаев. По данным

110

тайваньских ученых, при сравнительном исследовании результатов видовой идентификации 142 штаммов Candida spp. вышеуказанными методами,

обнаружили совпадение в 98,6% случаев [134]. В сравнительном исследовании, проведенном в Кувейте, с использованием анализаторов Vitek

МS, Bruker Biotyper МS и ДНК–секвенирования установлено, что методом

MALDI-TOF масс-спектрометрии точно идентифицировано 86,7% изолятов.

Не удалось определить 1 штамм C. famata, 2 штамма C. kefyr, 1 штамм C. guilliermondii. Были затруденения с идентификацией криптических видов комплекса C. parapsilosis [92]. Совпадение результатов по идентификации

Candida spp. MALDI-TOF масс-спектрометрией с другими биохимическими системами (Vitek 2) составило 93,2% [68]. Голландские исследователи при изучении 19 изолятов клинически значимых дрожжей (8 видов из двух родов), идентифицированных методом ДНК-секвенирования, показали что,

MALDI-TOF масс-спектрометрией и биохимической тест-системой API

определено 94, 7% [161 ].

При исследовании 322 штаммов Candida spp. с помощью MALDI-TOF

масс-спектрометрии и тест-системы AUXACOLOR2 нами обнаружено, что совпадение результатов идентификации составляет 93,2%. В аналогичном исследовании в Германии в 2010 г. совпадение между результатами MALDITOF масс-спектрометрии и AUXACOLOR2 составило 96,9% [86].

Наибольший процент несовпадений в нашем исследовании возникал из-за ошибочной идентифицикации некоторых изолятов Candida spp. тест-

системой AUXACOLOR2. Так, 11 штаммов C. albicans были идентифицированы как C. dubliniensis. Кроме того метод AUXACOLOR2 не обеспечивал выявление редких видов (C. utilis, C. inconspicua, C. bracarensis, C. pararugosa). Таким образом, тест-системой AUXACOLOR2 определили,

что 39,7% клинических изолятов принадлежли к C. albicans, и 59,7% –

являются представителями других видов Candida, у 0,6% штаммов вид не определен. Методом MALDI-TOF масс-спектрометрии установлено, что

43.2% клинических изолятов принадлежали к C. albicans, и 56.8% были