4 курс / Дерматовенерология / Диссертация_Рауш_Е_Р_Особенности_возбудителей_внутрибольничного

51

Минимальная подавляющая концентрация (МПК) - самая низкая концентрация антимикробного препарата, который вызывает специфическую остановку видимого роста в агаре или при определении чувствительности методом разведении в жидкой питательной среде [45, 46].

2.7.1 Метод микроразведений в жидкой питательной среде – CLSI M27-

A3

В данном исследовании применяется версия протокола (2008 г.) и

критерии интерпретации результатов (2008 г. и 2012 г.).

Инокулюм готовили из 5 колоний 24-часовой культуры Candida spp. на чашке Петри, суспендируя их в 5 мл 0,85% стерильного раствора NaCl до соответствия стандарту мутности 0,5 McFarland (1х106 – 5х106 клеток/мл).

Рабочие суспензии далее разводили 1: 50 0,85% стерильным раствором NaCl,

затем жидкой средой RPMI 1640 - 1: 20 (1х103 -5х103 ) клеток/мл.

Для приготовления разведений субстанции противогрибковых препаратов промышленного приготовления (Sigma, Германия) флуконазол растворяли в стерильной воде, другие препараты (каспофунгин, позаконазол,

вориконазол) – в диметилсульфоксид (ДМСО). Далее готовили основные растворы противогрибковых препаратов в концентрации 1280 мкг/мл. Затем,

в соответствии со схемами, указанными в стандарте, разводили рабочие растворы противогрибковых препаратов: для вориконазола, позаконазола диапазон концентраций устанавливали от 0,0313 до 16 мкг /мл, для флуконазола - от 0,125 до 64 мкг /мл, для каспофунгина – от 0,015 до 8 мкг

/мл.

Выполнение микроразведений в жидких питательных средах проводили в стерильных одноразовых, 96-луночных планшетах с U-

образными лунками. Двукратные концентрации препаратов вносили в ряды с

1 по 10 лунки планшета в объеме 100 мкл микроканальными пипетками.

Первые лунки рядов содержали самые высокие (64 или 16 мкг/мл)

52

концентрации препарата, а десятые лунки - самые низкие концентрации препарата (0,12 или 0,03 мкг/мл). Далее в каждую лунку планшета вносили по 100 мкл соответствующего двойного разведения суспензии инокулюма,

таким образом, получая разведения препарата и плотность инокулюма в конечной концентрации. Лунки контроля роста содержали 100 мкл стерильной среды, без препарата с соответствующим разведением суспензии инокулюма. Последнюю лунку планшета использовали для контроля стерильности (среда без препарата). В качестве контроля качества исследования использовали тест-культуру C. parapsilosis ATCC 22019

(РКПГY-1245). Планшеты инкубировали в термостате при температуре 350С

в течении 24 часов. Учет результатов производили визуально с использованием следующей цифровой шкалы: 0 - оптически прозрачно,1-

легкая мутность, 2- заметное снижение (~ 50%) видимого роста, 3 – слабое подавление видимого роста, 4 – нет подавления видимого роста. Далее сравнивали с критериями интерпретации МПК флуконазола, вориконазола и каспофунгина (2008 г., 2012г) указаны в таблицах 6 и 7.

Таблица 6 – Критерии интерпретации CLSI M27-S3 (2008 г.)

53

Таблица 7 – Критерии интерпретации результатов определения

чувствительности (CLSI M27-S4, 2012 г.)

штаммов < 1 мкг/мл [46, 47, 168, 169, 183].

54

2.7.2 Диско-диффузионный метод определения чувствительности -

CLSI M44-A

Использовали бумажные диски (производство Oxoid, Великобритания)

диаметром 6 мм, пропитанные противогрибковыми препаратами (диски с вориконазолом содержали 1 мкг препарата, диски с флуконазолом – 25 мкг препарата) и плотную питательную среду Мюллер-Хинтона, содержащую 2%

глюкозу и 0,5 мкг/мл красителя метиленового синего [45].

Для приготовления инокулюма использовали суточные культуры исследуемых Candida spp. Мутность инокулюма соотвествовала 0,5 McFarland (1х106 - 5х106 клеток/мл ).

Посев инокулюма проводили не позднее, чем через 15 минут с момента его приготовления. Стерильный хлопковый тампон несколько раз погружали в инокулюм, затем переносили в чашку Петри со средой Мюллер-Хинтон и растирали по всей поверхности среды, постепенно вращая тампон, для

получения роста «газоном» и полного впитывания инокулюма в среду.

Диски с флуконазолом и вориконазолом наносили стерильным пинцетом на поверхность засеяной чашки, слегка придавливая для получения наибольшей площади соприкосновения со средой. Инкубировали при температуре 350С

18-24 часа. Учет результатов проводили автоматически с помощью микробиологического анализатора BIOMIC Vision (Giles Scientific, США) по диаметру зоны задержки роста (Таблица 8). [2, 45]. В качестве контроля качества исследования использовали тест-культуру C. parapsilosis ATCC

22019 (РКПГY-1245).

Таблица 8 – Критерии интерпретации метода М44-А

55

Определение чувствительности по стандарту CLSI M44-A было проведено в НИЛ микологического мониторинга и биологии грибов НИИ медицинской микологии им.П.Н.Кашкина (Зав. лабораторией Богомолова Т.С., исполнитель - н.с. Выборнова И.В.)

2.7.3 Определение чувствительности с помощью микробиологического

анализатора Vitek 2 Compact

Использовали автоматический анализатор Vitek 2 Compact (bioMerieux).

В качестве расходного материала использовали пластиковые карты ASTYS01 (bioMerieux), содержащие в запаянных лунках серийные разведения противогрибковых препаратов ( флуконазол, вориконазол, амфотерицин В, 5-

флуцитозин) [49,76].

Осуществление методики проводили в соотвествии с рекомендациями производителя. Из суточной культуры Candida spp. готовили суспензию в 3

мл 0,85% раствора NaCl в специальной пластиковой пробирке, затем пробирку вместе с картой AST-YS01 помещели в ячейки кассеты Vitek 2 Compact и устанавливали в прибор. Время определения чувствительности дрожжей к противогрибковым препаратам составляло 18-35 часов.

Полученный результат автоматически выдавался после завершения определения чувствительности. Анализ данных проводили в соотвествии со стандартами интерпретации МПК CLSI M27-А3 S4 (2012).

2.8 Статистическая обработка результатов

Результаты исследования обрабатывали с помощью программы

STATISTICA for Windows версия 6.0. Использовали непараметрические и параметрические методы. Критерием статистической достоверности получаемых данных считали общепринятую в медицине величину р<0.05 [12].

56

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВИДОВОГО СПЕКТРА КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ CANDIDA SPP.

3.1 Источники выделения возбудителей инвазивного кандидоза

В период с 2011 по 2014 гг. исследовали биосубстраты от 284

пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом (из 37 стационаров,

в 12 городах России). Образцы периферической крови, перитонеальной и плевральной жидкостей, содержимого абсцессов внутренних тканей,

цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), биоптатов (мочеточник, кишечник,

легкие, тромб сердца при аутопсии), желчи и пунктата суставной жидкости на питательные среды высевали наагар Сабуро. Было выделено 322 изолята грибов рода Candida (рисунок 5). Биосубстраты были получены,

преимущественно, в результате многоцентрового исследования из отделений реанимации и интенсивной терапии.

8 6 6 5 4 1

24

268

Рисунок 5 – Виды биоматериалов, из которых выделены возбудители ИК

(n=322).

57

В большинстве случаев (83,2%) возбудители внутрибольничного инвазивного кандидоза выделены из крови (рисунок 7).

Видовую идентификацию клинических изолятов Candida spp. осуществляли с помощью различных методов (ДНК-секвенирования, MALDI-TOF масс-

спектрометрии, тест-системы AUXACOLOR2).

3.2 Сравнение результатов видовой идентификации Candida spp.

методами ДНК-секвенирования и MALDI-TOF масс-спектрометрии

Определили видовую принадлежность 97 штаммов грибов из рода

Candida референтным методом - ДНК-секвенированием, в соответствии с международным протоколом CLSI MM18-A (рисунок 6) и методом MALDITOF масс-спектрометрии (рисунок 7).

7.21 1 1 1

12.5

Рисунок 6 – Спектр грибов рода Candida, идентифицированных методом ДНК-секвенирования (n=97).

По результатам исследования 97 штаммов методом ДНК-

секвенирования было определено 9 видов Candida, среди которых C. albicans

- 50,5%, другие виды Candida - 49,5% (C. parapsilosis - 14,4%, C. tropicalis –

58

12,4%, C. glabrata - 11,4%, C. krusei - 7,3%, C. lipolytica,C. lusitanie, C. bracarensis, C. kefyr - по 1,0 %).

По результатам видовой идентификации методом MALDI-TOF масс-

спектрометрии 97 изолятов Candida spp. также определены 9 видов Candida

(рисунок 9), среди которых 50,5% штаммов составляли C. albicans и 49,5 %

составляли C. не - albicans виды (C. parapsilosis - 14,4%, C. tropicalis – 12,4%,

C. glabrata – 11,4%, C. krusei - 7,3%; C. lipolytica, C. lusitanie, C. bracarensis и C. kefyr - по 1,0%).

7.21 1 1 1

12.5

Рисунок 7 – Видовой спектр Candida spp., определенный методом MALDITOF масс-спектрометрии (n=97).

При сравнении результатов, полученных методом MALDI-TOF масс-

спектрометрии и ДНК-секвенирования обнаружено совпадение в 100%

случаев (таблица 9).

59

Таблица 9 – Результаты идентификации видов Candida spp. с помощью

методов ДНК-секвенирования и MALDI-TOF масс-спектрометрии (n=97)

Примечание. ИД - идентификация Так как ДНК-секвенирование является дорогим, трудоемким,

продолжительным по времени методом, требующим специально обученного персонала, в настоящее время его неприменяют в большинстве микробиологических лабораторий.

Учитывая сопоставимость результатов двух методов, в качестве альтернативного мы применили метод быстрой и точной диагностики –

MALDI-TOF масс-спектрометрии. В дальнейшем исследовании мы сравнили результаты видовой идентификации возбудителей ИК, полученных методами

MALDI-TOF масс-спектрометрии и биохимической тест-системой

AUXACOLOR2.

3.3 Сравнение результатов видовой идентификации штаммов

Candida spp. методами MALDI-TOF масс-спектрометрии и тест-системой

AUXACOLOR 2

Всего изучено 322 штамма Candida spp., выделенные от больных с ИК.

По результатам видовой идентификации методом MALDI-TOF масс-

спектрометрии выявлено, что исследуемые штаммы принадлежали к 14

60

видам грибов рода Candida: C. albicans – 139 (43,2%), C. parapsilosis – 65 (20,2%), C. glabrata – 37 (11,5%), C. tropicalis – 31 (9,6%), C. krusei – 20 (6,2%), C. guilliermondii – 17 (5,3%), C. lusitaniae – 4 (1,3%), C. pararugosa – 2 (0,6%), C. dubliniensis – 2 (0,6%), C. inconspicua – 1 (0,3%), C. bracarensis

– 1 (0,3%), C. utilis- 1 (0,3%), C. kefyr – 1 (0,3%), C. lipolytica – 1 (0,3%).

Таким образом, методом MALDI-TOF масс-спектрометрии, определено, что

43,2% клинических изолятов принадлежат к C. albicans, и 56,8% являются представителями C. не-albicans видов, а среди часто встречающихся штаммов C. не-albicans видов, выявлены также и более редкие виды - C. utilis,

C.pararugosa и C. inconspicua (рисунок 8).

0.60.3 0.3

9.6

Рисунок 8 – Видовой спектр Candida spp., определенный методом MALDITOF масс-спектрометрией (n=322).

С помощью тест-системы AUXACOLOR2 среди 322 исследуемых штаммов - возбудителей ИК идентифицировали 11 видов грибов рода

Candida: C. albicans – 134 (41,6%), C. parapsilosis - 65 (20,2%), C. glabrata –