4 курс / Дерматовенерология / Диссертация_Рауш_Е_Р_Особенности_возбудителей_внутрибольничного

41

приводят к появлению устойчивости против всего класса эхинокандинов одновременно [125].

В литературе нет единодушного мнения по вопросу перспективности для клинической практики комплекса методов определения чувствительности к антимикотикам, основанных на изучение геномных последовательностей, хотя ряд ученых видят за ними будущее персонифицированных подходов к антифунгальной терапии [31]. Также следует отметить, что прямое или косвенное определение МПК не позволяет предсказать результат лечения. А вот обнаружение некоторых мутаций в генах, кодирующие белки-мишени воздействия антимикотических преапаратов, позволяет это сделать. Но для успешного применения этого подхода необходима разработка быстрых и эффективных методов определения мутаций [142]. Их примерами могут послужить ПЦР-РВ, ПДРФ,

SPR-технология, методы ДНК-чипов и масс-спектрометрии [1, 10, 63, 84, 112].

Анализ полиморфизма рибосомальных межгенных транскрибируемых спейсеров (ITS), последовательности локуса D1/D2 гена большой рибосомальной субъединицы, последовательности гена бета-тубулина,

являющиеся в настоящее время «золотым стандартом» видовой диагностики микромицетов, позволяющие изучать филогенетические отношения между близкородственными видами, а также изучать филогению между популяциями внутри вида и между отдельными видами, рассматривается и как предикторы проявления резистентных качеств изолятов грибов к антимикотической терапии.. В частности, Маккаллу с соавторами удалось соотнести генетические варианты C. albicans, определённые методом ПДРФ,

с проявлением устойчивости к флуцитозину [104]. Аналогичные данные (по флуцитозину, но не по флуконазолу и итраконазолу) методом мультилокусного секвенирования-типирования для гриба того же вида получены в работе Таванти с соавторами [131]. Для рода Aspergillus с

помощью молекулярно-филогенетических подходов описаны виды, не

42

различающиеся по морфологии, но проявляющие различную восприимчивость к противогрибковым препаратам [19]. Эти примеры показывают возможную перспективность изучения разнообразия геномных последовательностей, используемых ранее для типирования, грибов рода

Candida, в частности локуса D1/D2 гена 28S рРНК, для выявления резистентных изолятов.

Таким образом, в связи с актуальностью проблемы, выбор оптимальных методов определения чувствительности для применения в рутинной практике имеет решающее значение, особенно для пациентов с внутрибольничным ИК.

43

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

При проведении данного диссертационного исследования изучены 322

клинических изолята грибов рода Candida, выделенные от 284 пациентов с внутрибольничным инвазивным кандидозом (37 стационаров,

преимущественно – отделения реанимации и интенсивной терапии 12

городов России) в течение 2011-2014гг. Большая часть культур Candida spp.

была получена в результате многоцентрового исследования внутрибольничного кандидоза. Исследуемые изоляты Candida spp. были выделены из образцов периферической крови, перитонеальной и плевральной жидкостей, содержимого абсцессов внутренних тканей,

цереброспинальной жидкости (ЦСЖ), биоптатов (мочеточник, кишечник,

легкие, тромб сердца при аутопсии), желчи и пунктата суставной жидкости при посеве на питательные среды. Возбудители ВБИК были идентифицированы до вида с помощью тест-системы AUXACOLOR2 (BioRad,США), методом MALDI-TOF масс-спектрометрии (Bruker,

Германия), ДНК-секвенирования. Определение чувствительности к противогрибковым препаратам исследуемых штаммов Candida spp.

проводили в соотвествии со стандартными протоколами CLSI M27-A3, CLSI M44-A, а также с помощью автоматического анализатора Vitek2Compact (BioMerieux).

2.2 Подготовка культур Candida spp.

Для выделения культур Candida spp. полученные образцы крови засевали на жидкие питательные среды – бульон Сабуро, флаконы системы посева крови Signal, (Oxoid), и анализатора гемокультур BactAlert (BioMerieux), инкубировали при 35 – 370С до 10 суток. При выявлении

44

признаков роста ( при их отсутствии – через 10 суток) пересевали на плотную питательную среду Сабуро в чашках Петри. Другие биосубстраты сеяли непосредственно на агар Сабуро и в среду обогащения (бульон Сабуро).

Параллельно с посевом биосубстраты микроскопировали, отмечали наличие дрожжевых клеток и псевдомицелия [3].

Часть изолятов Candida spp. были доставлены в лабораторию из других медицинских центров уже в виде культур. Их пересевали на агар Сабуро с антибиотиками для исключения бактериальной контаминации и после получения культуры микроскопировали при увеличении х 400 для проверки чистоты культуры. Выделенные чистые культуры Candida spp. хранили на скошенном агаре Сабуро в пробирках при температуре 4 – 60С.

Для определения видовой принадлежности штаммов Candida spp. и их чувствительности к противогрибковым препаратам использовали суточные культуры гриба, выращенные на агаре Сабуро при 370С (в случае C. lipolityca

– при 280С) [5].

2.3 Идентификация Candida spp. методом ДНК-секвенирования

Выделение ДНК микромицетов

Для выделения ДНК использовали двухдневные культуры Candida spp.

Выделение ДНК производили по модифицированому методу Doyle и Doyle

[59]. Разрушение клеточной стенки гриба проводили с помощью гомогенизатора Precellys со стеклянными шариками 5 мм (Sigma, США).

Фрагменты разрушенной клеточной стенки инкубировали с экстракционным буфером SDS 1% (100 mM NaCl, 500 mM Tris, pH 8.0, 10% SDS) в течение ночи при 650С. Далее проводили экстракцию хлороформ-изоамиловой (24:1)

смесью в течение 10 мин при 13 000 об/мин на микроцентрифуге MiniSpin (Eppendorf). ДНК осаждали этанолом при -200С, после чего концентрировали центрифугированием в течение 10 мин при 20 000 об/мин. Полученный осадок дважды промывали 70% спиртом, высушивали и растворяли в буфере

45

ТЕ. Концентрацию выделенной ДНК измеряли на флуориметре Qubit (Invitrogen, США).

Молекулярно-генетический анализ

Молекулярно-генетическая идентификация с помощью секвенирования ДНК проводилась согласно рекомендациям СLSI ММ18-А [49]. Идентификация основывалась на определении нуклеотидной последовательности регионов нетранскрибируемого межгенного спейсера ITS1 и ITS2, и фрагмента D1/D2

гена, кодирующего большую рибосомальную субъединицу 28S рРНК, с

использованием праймеров ITS4 и ITS5, и NL1 и NL4, для намножения соответствующих фрагментов генов ITS и D1/D2 [27], структура праймеров приведена в таблице 4. Полученные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле в трис-борат-ЭДТА буфере в присутствии бромистого этидия и визуализировали в УФ-свете. ПЦР-

продукты очищали с помощью набора для очистки ДНК «Омникс» (Омникс,

Санкт-Петербург).

Таблица 4 – Структура праймеров, используемых для идентификации микромицетов

Секвенирование ДНК выполнялось по методу Сэнджера на генетическом анализаторе ABI Prizm 3500 (Applied Biosystems, США). Реакцию проводили с использованием набора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) в объеме 10 мкл согласно рекомендациям производителя. Очистку от терминирующих аналогов нуклеотидов осуществляли набором BigDye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, США). Секвенирование выполнялось в обоих направлениях. Все

46

несоответствия между фенотипической и молекулярно-генетической идентификациями были проверены повторным секвенированием. Подготовку последовательности и секвенирование образцов осуществляли по стандартным протоколам, как описано ранее [6, 49]. Последовательности прочитывали с обеих нитей ДНК, после удаления структур праймеров. Затем проводили сравнение полученных последовательностей с последовательностями, депонированными в базе данных GenBank и базе данных Центра биоразнообразия грибов при Центральном бюро грибных культур (Нидерланды). Поиск в базе данных GenBank осуществляли по алгоритму megablast. Размер слова был 28 нуклеотидов для GenBank и 20 на

CBS, параметры по умолчанию. В анализ были взяты 414 нуклеотидов,

кодирующих фрагмент транскрибируемого спейсера ITS1, ген 5,8S

рибосомной РНК и фрагмент спейсера ITS2 и 416 нуклеотидов, кодирующие регион D1/D2 гена 28S pPНК [6, 27, 49, 59, 60, 121].

Данный метод видовой идентификации возбудителей внутрибольничного инвазивного кандидоза проводили в НИЛ молекулярно-

генетической микробиологии НИИ медицинской микологии им. П. Н.

Кашкина (зав. лабораторией Тараскина А. Е.).

2.4 Идентификация Candida spp. методом MALDI-TOF масс-

спектрометрии

В данном исследовании использовали прибор «Autoflex speed» TOF/TOF (Bruker, Германия) с программным обеспечением MALDI Biotyper 3.1.

Из суточной культуры дрожжей выделяли белковый экстракт, содержащий, в

основном, рибосомальные белки. Анализ проводили на масс-спектрометре с получением масс-спектро-профиля (МСП) и сравнивали МСП с базой данных для видовой идентификации. (программный пакет MALDI Biotyper 3.1).

47

На сегодняшний момент база данных MALDI Biotyper содержит сведения о 5627 видах микроорганизмов, в том числе о более чем 120 видах

Candida spp.

При исследовании нами клинических изолятов грибов рода Candida spp. использовали протокол полной экстракции белка с помощью этанола и муравьиной кислоты.

Суточную культуру исследуемого изолята Candida spp., полученную рассевом на чашке Петри с агаром Сабуро суспендировали в 300 мкл деионизированной воды в пробирке-эппендорфе, затем гомогенизировали смесь с помощью вортекса (Bio-San, Латвия) в течение минимум 1

минуты. Далее, к смеси в пробирку-эппендорф добавляли 900 мкл этанола и снова смешивали с помощью вортекса в течение минимум 1

минуты, а затем центрифугировали в течение 2 минут при 13000 об/мин

(Bio-San, Латвия). Образовавшуюся надосадочную жидкость полностью удаляли пипеткой. На следующем этапе к оставшемуся осадку добавляли

50 мкл 70% муравьиной кислоты и смешивали с помощью вортекса минимум в течение 1 минуты (70% муравьиную кислоту получали путем смешения 30 мкл дистиллированной воды и 70 мкл 100% муравьиной кислоты в чистой пробирке-эппендорф, перемешивая с помощью вортекса). Затем, к полученной смеси добавляли 50 мкл 100%

ацетонитрила, смешивали с помощью вортекса в течение минимум 1

минуты и снова центрифугировали в течение 2 минут при 13000 об/мин. 1

мкл надосадочной жидкости наносили на 2 парные лунки 384-луночной стальной полированной мишени, сушили при комнатной температуре (23 °С, 5 минут) и затем наносили 1 мкл раствора матрицы (α-циано-4-

гидроксикоричной кислоты) и сушили при комнатной температуре.

Подготовленную мишень помещали в масс-спектрометр.

В качестве калибранта использовали тест-стандарт белкового экстракта E.coli. Процедуру калибровки и проверки выполняли на ячейке планшета, содержащей образец бактериального тест-стандарта.

48

Полученный масс-спектр анализировали на основе базы данных идентификации микроорганизмов MALDI Biotyper 3.1. Результат учитывали по данным значения коэффициента видовой идентификации.

Использовали следующие критерии оценки результата MALDI-TOF масс-

спектрометрии: коэффициент < 2 – вид и род определены с точностью

100%; 1,8–1,99 – 100% определение рода, неуверенное определение вида;

> 1,79 – сомнительное определение рода [103, 164, 165, 167, 177, 182, 184].

2.4.1 Изучение комплекса видов Candida parapsilosis

Для определения внутривидового сходства исследуемых изолятов были отобраны штаммы C. parapsilosis, включая устойчивые к противогрибковым препаратам. Данные штаммы предварительно исследовали по вышеуказанной методике MALDI-TOF масс-спектрометрии, однако, с целью получения наиболее четких спектров, результаты фиксировали не с двух парных лунок, а с четырех. Полученные масс-спектры штаммов C. parapsilosis обрабатывали с помощью программного обеспечения MALDITOF Biotyper 3.1 Offline Classification, используя статистический анализ главных компонент (в приложении MATLAB). Далее с помощью метода PCA (Principal Component Analysis – анализ главных компонент) проводили построение дендрограммы, которая представляла собой графическое изображение близкородственных индивидуальных спектров по отношению к другим. Масс-спектры автоматически делились на кластеры, масс-спектры которых обозначались одним цветом [103].

49

2.5 Видовая идентификация возбудителей внутрибольничного

инвазивного кандидоза с помощью тест-системы AUXACOLOR2

Видовую идентификацию изучаемых изолятов Candida spp. с помощью

AUXACOLOR2 проводили в соответствии в прилагаемым к тесту руководством [30].

Помимо биохимических свойств гриба, учитывали и морфологические характеристики: способность к пигментации, образованию артроспор,

хламидоспор, росту при 370С, наличие мицелия/псевдомицелия, капсулы.

Затем по результатам характеристик гриба формировали цифровой код и сравнивали с таблицей кодов, прилагающихся к тест-системе AUXACOLOR2 [30, 165].

2.6 Изучение морфологических особенностей возбудителей инвазивного

кандидоза

Макроморфологические особенности исследуемых культур Candida spp.

изучали на «гигантских» колониях. Для этого готовили суспензии из суточной культуры гриба в 5 мл. стерильного 0.85% раствора NaCl, наносили каплю суспензии на поверхность агара Сабуро в центр чашки Петри и инкубировали 14 суток при 370С. Фотографировали колонии с помощью стереоскопического люминисцентного микроскопа SteREO Lumar.V12 (Carl Zeiss, Германия).

Особенности микроморфологии клеток культур грибов рода Candida

изучали с помощью флуоресцентного микроскопа AxioImager.Z1 (Carl Zeiss,

Германия), использующего оптику Номарского. Для этого готовили микропрепараты: на предметное стекло наносили каплю дистиллированной воды, в которую вносили культуру исследуемого микромицета, взятую бактериологической петлей с центральной и периферической поверхности

50

колонии, полученную суспензию накрывали покровным стеклом и изучали

особенности микроморфологии, проводили микрофотосъемку [7].

2.7 Методы определения чувствительности Candida spp. к

противогрибковым препаратам in vitro

Для 322 изолятов Candida spp. – возбудителей ВБИК была определена чувствительность к противогрибковым препаратам по протоколам CLSI (M27-A3, M44-A), а также на микробиологическом анализаторе Vitek2 Compact (BioMerieux).

Использованные основные термины и понятия приведены в таблице 5

Таблица 5 – Определение категорий чувствительности к противогрибковым препаратам