Количественная оценка гибели гепатоцитов и динамика некоторых биохимических параметров крови и желчи при экспериментальной механической желтухе

Введение

Исследования последних десятилетий показывают, что в патогене-

зе многих заболеваний печени наряду с некрозом гепатоцитов немаловажную роль играет и их апоптоз [1, 12, 17]. Однако в патологических условиях, где клетки испытывают разные по силе и длительности воздействия многих токсических агентов, выделить какой-либо из вариантов клеточной смерти как единственный не представляется возможным. Можно говорить лишь о преимущественном характере поражения. Поэтому

предлагается ввести в использование такой термин, как «некроапоптоз» [16].

Выделяют два основных механизма, ответственных за активацию процесса гибели кле-

ток: внутренний путь, реа-

лизуемый через митохондрии и запускаемый специфическими внутриклеточными стимулами (повреждение ДНК, повышение концентрации внутриклеточного Ca2+ и др.), и внешний путь, связанный с активацией рецепторов смерти (Fas, TRAILR2, TNF-R1), расположенных на поверхности клеточных мем­ бран. Оба эти пути нередко тесно взаимосвязаны. В част­

ности, активация рецепторов смерти может приводить не только к апоптозу клеток, но и к их некрозу [9].

Сказанное в полной мере относится к гибели гепатоцитов в условиях холестаза, который может сопровождать любой патологический процесс, протекающий в печени. Холестаз представляет собой наруше-

ется исследованиями, в которых

показано, что внутривенная инфузия солей ЖК в эксперименте приводит к токсическому повреждению гепатоцитов, сопровождающемуся повышением в крови маркеров цитолиза [19]. ЖК активируют рецепторы смерти и запускают каскад реакций, приводящих к гибели клетки. Неотъемлемой частью этого процесса являются повышение проницаемости мембран митохондрий,выделениепроапо­ птотических факторов, генерация активных форм кислорода, нарушение окислительного фосфорилирования и образования энергии [10, 15, 20]. Выявлено, что вариант гибели гепатоцитов (апоптоз или некроз) при воздействии солей ЖК зависит от их концентрации [11].

Большой интерес вызывает изучение апоптоза и некроза гепатоцитов при механической желтухе in vivo, поскольку количественные соотношения обоих вариантов клеточной смерти до настоящего времени не установлены. Однако количественная оценка событий, происходящих при этом, связана с определенными трудностями ввиду несовершенства большинства существующих методик [12, 14, 24]. Провести количественный анализ процессов, происходящих в печени при холестазе (и других патологических состояниях) позволяет метод проточной цитометрии, с помощью которого можно оценивать несколько различных оптических параметров больших популяций частиц в суспензии за меньшее время по сравнению с обычными мето-

дами [8, 23].

Целью нашего исследования

было изучение механизмов гибели гепатоцитов при экспериментальной механической желтухе методом проточной цитометрии и выявление связи с биохимическими показателями сыворотки крови и желчи, которые являлись бы маркерами повреждения клеток печени.

26

Материал и методы исследования

Исследование проведено на 30 белых беспородных кры- сах-самцах массой 250–350 г, разделенных на 5 групп по 6 животных в каждой. Анестезия осуществлялась внутрибрюшинным введением 25% раствора уретана (Sigma) в дозе 0,8 г/кг.

Основную группу составили

12 животных, которым были выполнены перевязка и пересечение общего желчного протока с целью моделирования механической желтухи. Гибель гепатоцитов изучалась у них через 1 и 3 нед от момента операции – I и III группы соответственно. У 12 животных выполнена лапаротомия с выделением общего желчного протока без его перевязки при тех же условиях, что и у опытных животных. Эти крысы составили II и IV группы лож-

нооперированных животных.

Изучение гибели гепатоцитов у них также осуществляли через 1 и 3 нед от момента опера-

ции. Контрольную (V) группу

составили 6 интактных крыс. Забор крови для анализа

производили при декапитации животного под эфирным раушнаркозом. После максимального обескровливания извлекали образец печени массой 100 мг. Желчь для анализа забирали путем аспирации из кистознорасширенного общего желчного протока у крыс с механической желтухой. Извлеченную ткань печени подвергали ферментативной диссоциации в 0,05% растворе коллагеназы (БиолоТ, СанктПетербург) [8]. Полученную при этом суспензию клеток разделяли центрифугированием на градиенте плотности фиколлурографина 1,140 г/мл при 400 g в течение 25 мин.

Анализ различных вариантов гибели гепатоцитов выполняли методом проточной цитомет-

рии (FacsCalibur, BD) в про-

грамме CellQuest. Количество погибших клеток определяли по уровню экспрессии молекул

фосфатидилсерина на наружной мембране гепатоцитов с помощью флуорохрома меро-

цианина 540 – MC540 (Sigma).

Некроз гепатоцитов оценивали по увеличению проницаемости их плазматической мембраны с помощью флуорохрома пропидий йодида – PI (Sigma). Критерием апоптоза являлась повышенная экспрессия фосфатидилсерина на мембранах гепатоцитов при неизмененной проницаемости для PI (MC540-PI). Биохимическиепараметрыкрови

–общий билирубин, щелочная фосфатаза (ЩФ), аланинаминотрансфераза (АлАТ), аспартатаминотрансфераза (АсАТ)

–исследовали с помощью наборов реагентов (БиолоТ, СанктПетербург) на спектрофотометре СФ103 по общепринятым методикам. Концентрацию ЖК в желчи определяли методом, основанным на способности 0,1% раствора хлорного железа в смеси равных объемов ледяной уксусной и концентрированной серной кислот реагировать с желчными кислотами [5]. Метод адаптирован нами для определения концентрации ЖК в сыворотке крови. Для этого построена калибровочная кривая с использованием стандарт­ ных сывороток, содержащих известные концентрации ЖК

(Dialab, Austria).

Статистическую обработку результатов осуществляли методом вариационной статистики с помощью программы

BIOSTATISTICA (S.A. Glantz, McGraw Hill). Все получен-

ные данные соответствовали нормальному распределению

ны на уменьшение токсического действия ЖК на органы и ткани. Это нашло отражение в изменении уровней экспрессии белков-переносчиков, участвующих в транспорте ЖК, на мембранах клеток [22]. Показано, что при холестазе на базолатеральной мембране гепатоцитов уменьшается экспрессия молекул Ntcp и Oatps, которые в норме участвуют в транспорте ЖК из крови в клетки (при энтерогепатической циркуляции ЖК). Вместе с тем происходит увеличение экспрессии белка MRP3, который переносит ЖК из цитоплазмы в кровь и в норме имеет низкий уровень экспрессии. Также повышается экспрессия белка MRP2 на люминальных мембранах энтероцитов и эпителии канальцев почек, что способствует увели-

Список литературы

1.Аруин Л.И. Апоптоз и патология печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. – 1998. – Т. 8, № 2. – С. 6–11.

2.Борщева Л.И. Билирубин и его фракции при экспериментальной обструкции общего желчного протока // Актуальные вопросы пато-

логии печени – Душанбе, 1969.

– Вып. 5. – С. 225–233.

3.Дудник Л.Б. Антиоксидантное и антиапоптотическое действие билирубина при патологии печени и желчевыводящих путей: Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. – М., 2004. – 44 с.

4.Магдиев Т.Ш. Динамика функциональных и морфологических изменений печени при механической желтухе: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. – М., 1973. – 24 с.

5.Мирошниченко В.П., Громашев­ ская Л.Л., Касаткина М.Г.,

Козачек Г.А. Определение содержания желчных кислот и холес-

терина в желчи // Лаб. дело.

–1978. – № 3. – С. 149–153.

6.Пехливанов Б., Цветкова Т., Пиперков Т., Чичовска М. Щелоч­ ная фосфатаза: современное состояние вопроса (Обзор литературы) // Лаб. дело. – 1989. – № 11.

–С. 4–7.

7.Повзун С.А. Диагностика острой печеночной недостаточности в хирургической клинике // Вестн. хир. – 1993. – № 7. – С. 93–97.

8.Фрешни Р. Культура животных кле­

30

чению выделения ЖК с мочой и калом. Экспрессия же белка Isbt на эпителии кишечника и почек снижается, что вызывает уменьшение всасывания ЖК в кровь из их просвета.

Как отмечалось выше, накопление ЖК в клетках печени в результате нарушения их экскреции в желчь приводит к реализации токсических эффектов ЖК и к гибели гепатоцитов. По нашим данным, показатели гибели гепатоцитов и содержание ЖК в желчи имеют обратную зависимость. Таким образом, определение концентрации ЖК в желчи и ее динамики при обструктивном холестазе служит индикатором интенсивности гибели печеночных клеток.

ток. Методы: Пер. с англ. – М.: Мир, 1989. – 333 с.

9.Berghe T.V., van Loo G., Saelens X. et al. Differential signaling to apoptotic and necrotic cell death by Fas-associated death domain protein FADD // J. Biol. Chem. – 2004.

– Vol. 279, N 9. – P. 7925–7933.

10.Borgognone M., Roma M.G. Signa­ ling modulation of bile salt-induced necrosis in isolated rat hepatocytes // Toxicol. Sci. – 2005. – Vol. 83, N 1. – P. 114–125.

11.Danchenko E., Dargel R. Effect of bile acids on the proliferative activity

and apoptosis of rat hepatocytes

//Exp. Toxicol. Pathol. – 2001.

– Vol. 53, N 2–3. – P. 227–233.

12.Ghavami S., Hashemi M., Kadkhoda K. et al. Apoptosis in liver diseases – detection and thera­ peutic applications // Med. Sci. Monit. – 2005. – Vol. 11, N11.

– P. 337–3345.

13.Granato A., Gores G., Vilei M.T. et al. Bilirubin inhibits bile acid induced apoptosis in rat hepatocytes

//Gut. – 2003. – Vol. 52. – P.1774–1778.

14.Hall P.A. Assessing apoptosis: a critical survey // Endocrine-Rela­

ted Cancer. – 1999. – Vol. 6.

–P. 3–8.

15.Higuchi H., Gores G.J. Bile acid regulation of hepatic physiology IV. Bile acids and death receptors // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. – 2003. – Vol. 284.

–P. 734–738.

16.Lemasters J.J. Mechanisms of

Выводы

1.Проточная цитометрия

–высокоинформативный метод для оценки гибели гепатоцитов и ее вариантов при экспериментальной механической желтухе.

2.Преимущественным механизмом гибели гепатоцитов при экспериментальном обструктивном холестазе является апоптоз.

3.Уровень активности ЩФ в сыворотке крови и концентрация ЖК в желчи служат критериями для оценки интенсивности гибели гепатоцитов при обструктивном холестазе.

4.Содержание общего билирубина в сыворотке крови, а также активность АлАТ и АсАТ не имеют прогностического значения при оценке интенсивности гибели гепатоцитов в условиях механической желтухи.

hepatic toxicity V. Necroapoptosis and the mitochondrial permeability transition: shared pathways to necrosis and apoptosis // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol.

– 1999. – Vol. 276. – P. 1–6.

17.Patel T. Apoptosis in hepatic pathophysiology // Clin. Liver

Dis. – 2000. – Vol. 4, N 2.

–P. 295–317.

18.Schlaeger R., Haux P., Katter­ mann R. Studies on the mechanism of the increase in serum alkaline phosphatase activity in cholestasis: significance of the hepatic bile acid concentration for the leakage of alkaline phosphatase from rat liver // Enzyme. – 1982. – Vol. 28, N1.

–P. 3–13.

19.Schmucker D.L., Ohta M., Kanai S. et al. Hepatic injury induced by bile salts: correlation between biochemical and morphological

Материал и методы исследования

Для оценки частоты контаминации язвенного дефекта условно-патогенными грибами

использовался одномоментный ретроспективный анализ результатов эндоскопического исследования верхних отделов ЖКТ у больных ЯБЖ, проходивших амбулаторное и стационарное обследование в городском гастроэнтерологическом центре в

1999–2003 гг.

Для оценки факторов риска присоединения грибковой инфекции была сформирована

основная группа из 51 паци-

ента с ЯБЖ, осложненной присоединением УПГ. Проводилось одномоментное сравнительное

включала 105 больных ЯБЖ без признаков активной микотической инфекции.

Критериями исключения из исследования в обеих группах было наличие факторов риска генерализованных форм грибковой инфекции (массивная антибиотикотерапия и химиотерапия злокачественных новообразований в анамнезе), опухолевые процессы в желудке, оперативные вмешательства на верхних отделах ЖКТ, недавнее желудочное кровотечение, гематологические заболевания. Характеристика включенных в исследование пациентов представлена в табл. 1.

Всем больным при их добровольном согласии проводилось детальное клиническое обследование с подробным выяснением жалоб, анамнеза, осмотром и объективной оценкой состояния СО желудка. В перечень анамнестических факторов были включены следующие: рациональность питания (регулярность), курение (при выкуривании хотя бы одной сигареты/ папиросы в день), прием алкоголя (еженедельный), наличие психоэмоциональных перегрузок по оценке самих пациентов (постоянные психотравмирующие ситуации или сильные жизненные потрясения), контакт с производственными вредностями, наличие грибкового поражения других органов и систем. Для оценки трофологического статуса рассчитывался индекс Кетле: индекс массы тела (ИМТ) = масса тела, кг/рост, м2.

Инструментальные методы

включали выполнение фиброгастродуоденоскопии (ФГДС) с проведением щеточной биопсии

для получения мазка-отпечатка и материала для гистологического исследования из дна и краев язвы, определение кислотообразующей функции желудка с использованием рН-метра «Гастроскан 24» (Россия).

Лабораторная диагности-

ка базировалась на изучении общего анализа крови (количественная и качественная оценка форменных элементов) и показателей ее биохимического исследования (определение общего белка, белковых фракций, альбумина, анализ результатов функциональных проб печени и пр.).

Иммуноферментное исследо-

вание геликобактерной инфек-

ции проводилось при помощи тест-системы «ХеликоБест-анти- тела», выявляющей иммуно­ глобулины классов M, A, G

к антигену Cag A Helicobacter pylori (H. pylori). Для оценки Т-системы иммунитета служил метод розеткообразования.

Методы диагностики грибковой инфекции включали мик-

роскопическое исследование патологического материала, полученного при ФГДС (мазкаотпечатка и биоптата). Окраска мазков-отпечатков позволяет проводить поиск активных форм дрожжевых грибов – почкующихся клеток, псевдомицелия и мицелия, свидетельствующих о патогенности грибов. При вторичном инфицировании язвенного дефекта элементы грибов находятся в подслизистом слое дна язвы, ярко представлены признаки воспаления [1].

Статистическая обработка полученных данных проведена с применением пакетов про-

грамм SPSS 9,0.

Результаты

исследования и их обсуждение

Рис. 1. Частота клинических симптомов у больных язвенной болезнью желудка в зависимости от присоединения условно-патогенных грибов

* р<0,0001; ** р=0,008

Рис. 2. Частота локализации язвенных дефектов у больных язвенной болезнью желудка в зависимости от присоединения условно-патоген- ных грибов

* р=0,02; ** р<0,0001

34

(OR 7,0, 95% CI 2,67–18,33;

р<0,0001). В то же время риск присоединения УПГ значительно уменьшается при язвах менее

1,0 см (OR 0,2; 95% CI 0,09– 0,40; р<0,0001) – рис. 3.

Таким образом, увеличение размеров язвенного дефекта ассоциировано с повышенной вероятностью обнаружения УПГ при ЯБЖ, что согласуется с результатами, полученными другими авторами [1, 13].

По данным литературы [1, 9], средняя глубина язв составляет 5–20 мм, в разных участках она может быть неодинаковой и не всегда точно установленной, в связи с чем определение «глубокого» язвенного дефекта носит субъективный характер. При эндоскопическом исследовании глубокие язвы отмечены в 58,8% в основной группе и лишь в 24,8% в группе сравнения (р<0,0001). Доказано, что риск присоединения грибковой инфекции при глубоких язвенных дефектах выше в 4,3 раза

(95% CI 2,13–8,85; р<0,0001).

Подтвержденные морфоло-

гически атрофические измене-

ния СО желудка у пациентов с язвенной болезнью, осложненной присоединением УПГ, выявлялись достоверно чаще, чем в группе сравнения (OR 3,17; 95% CI 1,01–9,12; р=0,03).

Чаще обнаруживалась контаминация грибами язвенных дефектов и при наличии пилоричес-

кой метаплазии в теле желудка

(OR 9,17; 95% CI 2,44–34,43; р<0,0001) – табл. 2.

Существенное влияние на состав микрофлоры ЖКТ оказы-

вает кислотность желудочного сока, а гипохлоргидрию относят к одному из местных факторов риска грибкового поражения

Итак, нами выявлены общие и местные факторы риска присоединения УПГ к язвенным дефектам желудка (рис. 4 и 5). При наличии этих факторов у пациентов повышается вероятность осложнения ЯБЖ присоединением УПГ и таких лиц следует относить к группе риска. Им должно быть проведено целенаправленное обследование на наличие грибковой инфекции с обязательным взятием мазкаотпечатка из дна язвы.

Выводы

1.Частота язвенной болезни желудка, осложненной присоединением условно-патогенных грибов, составляет 6,4% среди больных с данной патологией, при этом преобладают мицелярные (вегетирующие) неинвазивные формы (95,2%) грибковой инфекции.

2.Дефекты слизистой оболочки желудка при язвенной болезни, осложненной присоединением условно-патогенных грибов, ассоциированы с большей их глубиной и размерами.

3.К местным факторам, ассоциированным с грибковой инфекцией язвенных дефектов, относятся: пилорическая метаплазия в теле желудка, локализация язвенного дефекта в теле желудка, снижение кислотообразующей функции желудка, атрофические изменения слизистой оболочки желудка.

4.К общим факторам, повышающим вероятность присоединения УПГ к язвенным дефектам СОЖ, относятся: значительное снижение массы тела, анемический синдром, снижение уровня общего белка сыворотки крови менее 65 г/л.