4 курс / Акушерство и гинекология / Перитонеальные_макрофаги_и_репродуктивная_система_женщин_Храмова

и в лунки вносится по 0,25 мл среды 199, производится 4-6-кратное замораживание-оттаивание с целью разрушения клеток и их лизосом для дальнейшего установления уровня лизоцима.

Оценивается показатель прилипаемости (ПП) по общему лизоциму (Lобщ), состоящему из секретированного (Lсекр) и внутриклеточного лизоцима (Lвн кл), и выражается в мкг/мл:

ППмкг/мл = Lобщ (Lсекр + L вн кл).

Изучение поглотительной способности фагоцитирующих клеток

Специально изготовленные плексигласовые пластины 5×3×1 см, в которых просверливаются параллельно расположенные сквозные отверстия диаметром 1,0 см, фиксируются расплавленным парафином на химически чистые предметные стекла.

Вобразованные лунки вносится 0,25 мл выделенной смеси клеток

вконцентрации 6×106 кл/мл, пластины ставятся на 60 мин. в термостат (37oС) для прикрепления клеток, после чего лунки промывают средой 199. В лунки вносят фагоцитируемые объекты (0,1 мг/мл частиц зимозана в среде 199) в объеме 0,25 мл. Реакция проходит при 37oС в течение 60 мин.

По истечении времени инкубации плексиглазовую пластину снимают, и предметное стекло промывают физиологическим раствором, высушивают, окрашивают по методу Д.Л. Романовского. В окрашенном мазке определяют фагоцитарный показатель (ФП) и фагоцитарное число (ФЧ) общепринятым методом.

Определение стабильности лизосомных мембран, секретированного и синтезированного лизоцима макрофагальных клеток

Реагенты и оборудование:

1.  Фиколл-верографин с 0,18% ЭДТА-Na (Д=1,076): 17 мл 8% фиколла (Ficoll 400, Pharmacia Sweden; простерилизован УФО в течение 60 мин. и разведен стерильной дистиллированной водой) смешивают с 7 мл 32,8% раствора верографина (Спофа, Чехословакия; готовят стерильно смешиванием 41 мл 76% верографина и 54 мл стерильной дистиллированной воды). К полученной смеси добавляют стерильный 6% раствор ЭДТА-Na (Трилон Б «ч» Уфимский химзавод) из расчета 0,3 мл на 10 мл раствора фиколл-верографина.

2.  Исследуемый материал (кровь, перитонеальный экссудат женщин).

3.Культуральная среда: среда 199 с 0,5% простерилизованного УФО L-глутамина (Reanal, Будапешт) и 2,5% смешанной человеческой сыворотки, прогретой при 56oС в течение 30 мин.

4.Micrococcus lysodeicticus.

5.Кристаллический лизоцим и агароза (марка Б Олайнский завод химреактивов).

6.I/15 М фосфатный буфер (рН = 6,2): 18,7 мл I/15 М Na2HPO4+ 81,3 мл I/15 М раствора KH2PO4.

7.Центрифуга лабораторная клиническая ОПН-3.

8.Пробирки (центрифужные, бактериологические, градуированные), пипетки на 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 мл, капилляры или микрошприц.

9.Флаконы на 2,0 мл с плоским дном, диаметром 1,0 см. Каждый флакон протирают внутри, особенно тщательно дно, содой при помощи влажной ваты, захваченной глазным пинцетом. Флаконы промывают проточной водой 15–20 раз и горячей дистиллированной водой, сушат, стерилизуют в сушильном шкафу.

10.Плитка электрическая.

11.Аналитические весы.

12.Стеклянные пластины 12×18 см и П-образная прокладка толщиной 2,0 мм.

13.Гель пробойник диаметром 2,0 мм (готовится затачиванием иглы одноразового пользования).

14.Низкотемпературный холодильник.

15.Металлические штативы с 40 гнездами, изготовленные самостоятельно (в металлической пластине 20×8×1,7 см высверливают на расстоянии 2,0 см друг от друга гнезда диаметром 1,6 см, высотой 1,5 см).

16.Микроскоп МБИ.

17.Стеклянные стаканчики на 50,0 мл. Этапы постановки:

1.Подготовка клеток для исследования.

*Выделение мононуклеарных клеток крови: в стерильные градуированные пробирки на 10,0 мл вносят стерильный 6% раствор ЭДТАNa в объеме 0,15 мл. Венозную кровь берут в асептических условиях в данную пробирку до метки 5,0 мл. Содержимое пробирки тщательно перемешивают.

В стерильные центрифужные пробирки вносят 1,0 мл стерильного раствора фиколл-верографина (Д=1,076), после чего наслаивают исследуемую кровь в объеме 5,0 мл. Пробирки маркируют карандашом по стеклу и центрифугируют при 1500 об./мин. в течение 20 минут.

Выделенное кольцо мононуклеаров отсасывают пипеткой вместе с нижним слоем плазмы крови и частью градиентного раствора и переносят в стерильную пробирку. Полученную клеточную взвесь без дополнительного отмывания на данном этапе градиентного раствора, что обеспечивает на 20% более высокий выход жизнеспособных клеток, разводят до конечной концентрации ЭДТА Na 0,056% средой 199 путем смешивания 1 части полученной клеточной взвеси и 2-3 частей среды. Концентрацию клеток считают в камере Горяева и доводят стерильным физиологическим раствором до 6×106 кл /мл.

* Получение перитонеальных макрофагов производят, как описано выше, путем пункции заднего свода влагалища с последующим отделением макрофагов их прикреплением к стеклу.

2. Культивирование прилипающих клеток.

В стерильные 2 мл плоскодонные флаконы (3 флакона на одно исследование) вносят по 0,25 мл клеточной взвеси. Клетки прикрепляются в течение 60 мин. при комнатной температуре, после чего неприлипшие клетки удаляют отмыванием средой 199. Для этого жидкость из флакона сливают,вофлаконвносят0,5млсреды199,ивновьжидкостьсотмытыми клетками удаляют, затем флаконы снова заполняют средой 199 до краев. Жидкость удаляют, и во флакон вносят 0,2 мл культуральной среды. Флаконы закрывают резиновыми пробками над спиртовкой, маркируют и ставятвтермостатпри+37oСна4-6или12-15часов,какудобнодляработы.

3. Микрометодом проводят определение секретированного (Lсекр) и после заморозки/разморозки общего лизоцима (Lобщ).

На основании результатов секретированного и общего лизоцима находят показатель стабильности лизосомных мембран (ПСЛМ) по

формуле:

ПСЛМ = Lсекр / Lобщ×100%.

Падение ПСЛМ ниже общепринятого стандарта здоровых людей 53-58% говорит за стабилизацию лизосомных мембран, повышение – за лабилизацию.

По результату оценки разницы общего лизоцима после и до культивирования рассчитывают количество синтезированного лизоцима

Микрометод определения лизоцима

Лизоцим определяют с помощью индикаторной культуры Micrococcus lysodeicticus, для получения которой заранее делают посев на скошенный МПА. Полученную микробную культуру смывают

скосячка 2 мл фосфатного буфера стеклянной палочкой, доводят взвесь до гомогенного состояния. Готовят рабочую концентрацию 5×107 микр./мл.

К8,0 мл фосфатного буфера в стеклянном стаканчике добавляют навеску агарозы 0,1 г. Взвесь агарозы плавят на плитке, доводят трижды до закипания. Расплавленную агарозу охлаждают до 45oС и смешивают с 2,0 мл взвеси тест-культуры. Смесь перемешивают и заливают

вкамеру, состоящую из двух фотопластин и П-образной прокладки между ними, скрепленной прищепками. После застывания геля верхнюю пластину скользящим движением снимают, и прокладку удаляют. В геле аккуратно пробойником делают лунки на расстоянии 1,0 см друг от друга.

В лунки капилляром или микрошприцем вводят по 0,003 мл (объем лунки) вначале пробу с секретированным лизоцимом и без промывки капилляра – с общим, полученным из разрушенных клеток. Новый или промытый капилляр используют для внесения последующих проб. Одновременно, на эту же пластину помещают стандартный раствор кристаллического лизоцима, взятый в концентрации 0,76; 1,53; 3,06; 6,125; 12,5 мкг/мл. Пластину инкубируют в термостате во влажной камере в течение 2-3 часов, после чего ее замачивают в 5% растворе хлористого натрия на 15-18 часов для остановки реакции, выдерживают

вводопроводной воде в течение 2 часов. Производят измерение диаметра колец лизиса тест-культуры сразу и после высушивания геля. На основании результатов, полученных со стандартным лизоцимом, на миллиметровой бумаге строят график зависимости диаметров колец. По этому графику переводят значение диаметров колец лизиса, полученных из опытных проб, в единицы измерения концентрации лизоцима и выражают в мкг/мл [125].

Мы составили электронную таблицу-программу в Microsoft Еxcel,

спомощью которой осуществляли перевод диаметров колец лизиса микрококка под воздействием лизоцима в его концентрацию. Автоматически производится подсчет ПСЛМ (табл. 1).

Уровень гормонов сыворотки крови изучался с помощью ФСГ, ЛГ, пролактина, эстрадиола, прогестерона, тестостерона.

Определение количества фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) в сыворотке крови осуществлялось путем иммуннохемилюминесцентного анализа. В качестве твердой фазы использовались особенные полистирольные шарики, покрытые тест-специфическими

Таблица 1

Перевод диаметра кольца лизиса микрококка в концентрацию лизоцима

антителами. Шарик помещают в реакционную пробирку специальной формы, которая применяется в качестве емкости для инкубации, промывки и получения сигнала. После инкубации пробы с реагентом, меченным щелочной фосфатазой, отделяют от шарика с помощью вращения реакционной пробирки с высокой скоростью вокруг ее вертикальной оси. Шарик остается в пробирке безо всяких свободных меток.

Излучение появляется, когда хемилюминесцентный субстрат реагирует с меткой щелочной фосфатазы, связанной с шариком. Количество излучаемого света пропорционально количеству определяемого вещества, изначально присутствующего в образце.

Количественное определение пролактина происходит также путем иммуннохемилюминесцентного анализа.

Назначение: пролактин совместно с эстрадиолом стимулирует рост и развитие молочных желез во время беременности и лактацию после родов.

Сдерживает секрецию стероидов в яичниках, дозревание желтого тела и секрецию ЛГ и ФСГ.

Физиологическая гиперпролактенемия наблюдается только во время беременности.

Патологическая гиперпролактенемия угнетает гипоталамо-гипо- физарно-гонадную систему и становится частой причиной бесплодия и нарушения функций половых желез у женщин. В соответствии с рекомендациями ВОЗ, определение уровня пролактина в крови необходимо в качестве скринингового теста при первичном обследовании супругов, обращающихся в медицинские учреждения по поводу бесплодия.

Количественное определение лютеинизирующего гормона (ЛГ) осуществляется путем иммуннохемилюминесцентного анализа.

Количественное определение эстрадиола происходит путем иммуннохемилюминесцентного анализа.

Назначение: эстрадиол стимулирует развитие первой фазы менструального цикла, вызывая увеличение мышечного белка матки и гиперплазию эндометрия. Другими органами-мишенями эстрогенов у женщин являются влагалище, вульва, маточные трубы и молочные железы. Эстрадиол активизирует анаболизм, предотвращает потерю кальция в костях, совместно с другими эстрогенами отвечает за развитие вторичных половых признаков и определяет характерные физиологические и психологические особенности женщин.

Выявление уровня эстрадиола у женщин актуально оценке функции яичников, нарушениях менструального цикла и при контроле за овуляцией, индуцируемой с помощью лекарств.

Количественное определение прогестерона осуществляется путем иммуннохемилюминесцентного анализа.

Назначение: прогестерон способствует пролиферации слизистой матки, облегчает имплантацию оплодотворенного яйца, стимулирует развитие молочных желез и участвует в сдерживании овуляции в период беременности. Обладает антиандрогенной и антиальдостероновой активностью.

Концентрация прогестерона варьирует в зависимости от периода менструального цикла. Уровень циркулирующего в крови гормона остается низким в фолликулярную фазу, резко повышается во время лютеиновой фазы, достигая пика через 5-10 дней после максимальной выработки ЛГ в середине менструального цикла. Приблизительно к 4-му дню до очередной ожидаемой менструации, если беременность в период овуляции не наступила, происходит резкое снижение уровня циркулирующего прогестерона до концентрации, характерной для фолликулярной фазы.

Определение концентрации прогестерона в соответствии с данной схемой является простым и надежным методом подтверждения овуляции. Прогестерон имеет диагностическую значимость для беременных, поскольку способствует сохранению беременности, понижая чувствительность матки к веществам, вызывающим ее сократительную деятельность.

Количественное определение тестостерона осуществляется путем иммуннохемилюминесцентного анализа.

Назначение: тестостерон является анаболическим гормоном для соматических тканей, стимулирует эритропоэз. Необходим для поддержания либидо и потенции. У женщин легкая гиперандрогения проявляется себореей, угрями, алопецией и гирсутизмом, тяжелая – приводит к вирилизации, ожирению, аменорее и бесплодию. В процессе внутриутробного развития избыток тестостерона у девочек вызывает нарушение половой дифференцировки.

Определение интерлейкина-8 в сыворотках крови женщин происходит методом ИФА с использованием диагностических наборов R&D Diagnostics Inc., США (чувствительность составляет 1 пг/мл).

В основе метода лежит применение полистироловых планшет с адсорбированными антителами к интерлейкину-8. В лунки планшеты вносится исследуемая сыворотка, проводится инкубация, промывка для удаления несвязавшихся белков. Далее, в промытые лунки планшеты вносятся антииммуноглобулиновые антитела, меченные пероксидазой. Делается инкубация, промывка планшеты. В лунки добавляется специфичный для фермента субстрат (перекись водорода и хромоген – ортофенилдиамин). Учет результата реакции осуществляют с помощью иммуноферментного анализатора «Multiscan» (Финляндия). О наличии и количестве IL-8 судят по числу присоединившихся меченных пероксидазой антииммуноглобулинов. Оценивается на конечном этапе по изменению цвета и интенсивности окраски реакционной смеси. Рассчитывают количество цитокина путем построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы и выражают в пикограммах на миллилитр (пг/мл).

Иммуногистохимическое исследование экспрессии рецепторов к эстрогенам и прогестерону с использованием моноклональных антител (Dako, США) [77] проведено иммуногистохимическим методом. Материал, полученный в результате выскабливания полости матки, с кусочками ткани эндометрия фиксировался в нейтральном формалине, доставлялся в лабораторию. Фиксированные кусочки ткани эндометрия заливались парафином. Делались тонкие срезы, толщиной 4-5 мкм, с помещением их по 3-4 образца на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином.

Выявляли тканевые антигены авидин-биотиновым методом, в котором биотилированные вторичные антитела взаимодействуют с

Глава 3

Гормональный статус и морфофункциональная

активность моноцитов/макрофагов

3.1. Влияние гормонов гипофиза на морфофункциональную активность моноцитов/макрофагов

Изучение морфофункциональных особенностей клеток макрофагальной системы выявило разную их зависимость от уровней ФСГ, ЛГ, пролактина – гормонов гипофиза, принимающих непосредственное участие в регуляции репродуктивной функции [53]. Исследование предпринято в середине менструального цикла – в период, совпадающий с овуляцией при композиционном гормональном соотношении [225].

В ходе исследования выяснилось, что адгезивные свойства моноцитов крови и перитонеальных макрофагов (ПП) у женщин с пониженным уровнем ФСГ достоверно ниже (p<0,05), а с повышенным – выше (p<0,01) по сравнению с результатами клеток крови женщин с нормальным уровнем ФСГ, составляющего в фолликулярную фазу 2,8-11,3 mIU/ml и в лютеиновую фазу – 1,1-9,2 mIU/ml (табл. 2).

Поглотительная активность моноцитов/макрофагов, судя по ФП и ФЧ, снижается у женщин при уменьшении уровня ФСГ и повышается с увеличением этого гормона в сыворотке крови.

Однонаправленность изменений адгезивных и поглотительных свойств моноцитов крови и перитонеальных макрофагов, вероятно, предполагает общий механизм действия ФСГ на свойства клеток. Известно, что действие ФСГ через клеточные рецепторы опосредуется активацией ЦАМФ и, как правило, стимулирует синтетические процес-