4 курс / Акушерство и гинекология / Гогсадзе_Л_Г_Предгравидарная_подготовка_и_особенности_течения_беременности

31

(CD8, CD56, CD68, CD138), провоспалительных цитокинов и факторов роста (IL-1, IL-6, IFN-γ, TNF-α, TGF-β, VEGF), процессов пролиферации и апоптоза клеток (Ki-67, bcl-2, Bax, apo-protein), снижение интенсивности процессов склерозирования, стабилизация экстрацеллюлярного матрикса

(уровень металлопротеиназ, различные виды коллагенов). Аспирационная биопсия, пайпель-соскобы или цуги эндометрия могут выполняться на 7- 10-й дни менструального цикла в амбулаторных условиях [108].

Использование комплексного подхода к диагностике хронического эндометрита позволяет значимо повысить эффективность верификации диагноза, прогнозировать клиническое течение воспалительного процесса,

осуществлять корректный подбор фармакотерапии и проводить мониторинг лечебных мероприятий. В свою очередь, этиопатогенетически обоснованная терапия хронического эндометрита определяет полное клинико-морфологическое восстановление тканей эндометрия и его рецептивность, что, закономерно, обуславливает восстановление репродуктивной функции у этой категории пациенток.

Таким образом, основываясь на изучении данных литературы,

касающихся проблемы хронического эндометрита, необходимо отметить,

что многие аспекты этиологии, патогенеза, клинической картины и диагностики изучены достаточно подробно. Тем не менее, изучение основных направлений исследований – этиологические особенности и морфогенез заболевания, позволит выявить неуточненные механизмы формирования репродуктивных расстройств при хроническом воспалении,

что является необходимой составляющей в проведении комплексных лечебных мероприятий в программе предгравидарной подготовки.

32

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ОБСЛЕДОВАНИЯ

2.1 Клиническая характеристика групп обследованных

Исследование выполнено в 2010-2013 гг. на базе гинекологических отделений и родильного дома ГБУЗ «ГБК №36 ДЗМ» – клинической базе кафедры акушерства и гинекологии лечебного факультета МГМСУ.

Исследования выполнялись с информированного согласия пациентов и соответствовали этическим принципам, предъявляемым Хельсинской Декларацией Всемирной Медицинской Ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki, 1964; 2000).

Дизайн исследования состоял из двух этапов. На I этапе проведено проспективное обследование 70 женщин. В основную группу вошли 40 пациенток с морфологически верифицированным диагнозом хронический эндометрит. Контрольную группу составили 30 небеременных женщин с нормальным менструальным циклом без отягощенного акушерско-

гинекологического анамнеза. Группы исследования были сопоставимы по возрасту, средний возраст пациенток составил 31,4±5,2 года. Пациенткам основной группы в соответствии с выявленными данными инфекционного и иммуногистохимического методов обследования проводилась этиопатогенетически обоснованная предгравидарная подготовка.

На II этапе согласно задачам исследования проведён анализ течения беременности, родов, послеродового периодов у 40 женщин основной группы и 30 женщин группы сравнения (для оценки эффективности терапии) без предгравидарной подготовки, имеющих в анамнезе хронический эндометрит. Обследованные соотносились по возрасту, средние значения которого составили 32,1±5,6 лет. В группе сравнения

33

диагноз хронического эндометрита подтверждался результатами патологоанатомического исследования последов.

Изучено 70 медицинских историй стационарного больного (форма 003/у), индивидуальных карт беременной и родильницы (форма №111/у); историй родов (форма № 113/у), историй развития новорожденного (форма № 097/у), протоколы патологоанатомического исследования последов, соскобов эндометрия. Обследование женщин проведено в соответствии со стандартами объемов обследования и лечения в акушерстве и гинекологии [79].

Данные обследования фиксировались в разработанную статистическую карту, и включали в себя: общие анамнестические сведения, данные о возрасте, соматическом статусе, акушерско-

гинекологическом анамнезе, сведения об особенностях менструальной функции, паритете родов. Большое значение придавалось выявлению факторов риска хронического эндометрита, наличию воспалительных заболеваний придатков матки, репродуктивных потерь при предыдущих беременностях, особенностях их развития и лечения, проведенных реабилитационных мероприятиях.

Критерии включения в исследование:

–морфологически подтвержденный диагноз хронического эндометрита;

–возраст 1736 лет;

–возможность динамического наблюдения

–согласие на участие в проведении исследования.

Критерии исключения:

–тяжелые экстрагенитальные заболевания;

–острые инфекционные заболевания;

–отказ от участия в исследовании.

34

2.2. Микробиологическое исследование влагалищной флоры,

цервикального канала и полости матки

С целью уточнения этиологической структуры инфекционно-

воспалительного процесса в эндометрии проведено комплексное исследование микроценоза влагалища, цервикального канала и полости матки (биоптата эндометрия) у пациенток обеих групп. Дизайн лабораторного исследования определялся принципом последовательного изучения микрофлоры по биотопам: влагалище, цервикальный канал и далее полость матки (эндометрий).

Состояние микробиоценоза оценивали при комплексном микробиологическом исследовании с помощью микроскопии мазков,

окрашенных по Граму, культуральном исследовании, а также молекулярно-биологическом исследовании ДНК генитальных инфекций методом ПЦР-диагностики. С учетом дизайна исследования, особенности забора материала, заключались в исключении контаминации биоптата эндометрия микрофлорой нижних отделов гениталий. С этой целью последовательно проводили обработку различных локусов антисептиком

(октенисептом): после взятия на исследование вагинального отделяемого обрабатывали влагалище, шейку матки, а затем цервикальный канал

(дважды с помощью бактериологическго тампона, смоченного антисептиком, с интервалом 5 минут). Контроль стерильности цервикального канала проводили посредством культивирования отделяемого цервикального канала в аэробных и анаэробных условиях.

При проведении микроскопии материал для исследования

(вагинальное отделяемое, содержимое цервикального канала, фрагменты биоптата эндометрия) окрашивали по Граму и исследовали под микроскопом при увеличении с иммерсией, а также проводили

35

культуральное исследование в аэробных условиях и при пониженном содержании кислорода в атмосфере СО2. При микроскопии состояние микробиоценоза оценивали по совокупности признаков: наличие лейкоцитарной реакции; характер эпителия; качественный и количественный состав микрофлоры.

Материал для бактериологического исследования из цервикального канала и полости матки получали с помощью специальных одноразовых стерильных инструментов (скринет и эндобраш, производство фирмы

HARMA-MED Inc.).

Содержимое цервикального канала и гомогенизат биоптата эндометрия наносили на набор стандартных питательных сред и культивировали в аэробных, анаэробных условиях и условиях пониженного содержания кислорода.

Посев на кокковую флору проводили на молочнокислый агар (для выделения штаммов стафилококка) и на кровяной агар (для обнаружения стрептококка), на среду Эндо и Расселя - для выявления кишечной флоры.

Генитальные микоплазмы (Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum) выделяли с помощью тест системы «Mycoplasma DUO»

(«BIORAD»). Инкубация сред проводилась при температуре 37°С в течение 18 часов. Микроаэрофилы (гарднерелла, лактобацилы)

выращивали в условиях пониженного содержания кислорода в атмосфере СО2 в эксикаторе. Строгие анаэробы культивировали с использованием строгой анаэрбной техники: в анаэробной камере в атмосфере трехкомпонентной газовой смеси (N2 – 80%, CO2 – 10%, H2 – 10%).

Выделенные микроорганизмы идентифицировали по видовому составу, определяли их количество в пересчете на 1 мл пробы (КОЕ/мл) и

определяли чувствительность к антибиотикам диско-диффузным методом

(10 дисков).

36

Результаты интерпретировали по общепринятым методикам с учетом рекомендаций, приведенных в Приказе МЗ России от 22.04.1985 г. «Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях ЛПУ».

Исследования по выявлению ДНК хламидий, генитальных уреаплазм, микоплазм, вируса простого герпеса I и II типов,

цитомегаловируса, вируса папилломы человека осуществлялись на основе метода ПЦР - диагностики и проводились в лаборатории молекулярной диагностики в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции» (ГК СЭН, 1995).

Материалом для ПЦР-исследования служили соскобы эпителия цервикального канала, нативного биоптата эндометрия, взятые отдельными одноразовыми, стерильными зондами, в соответствии с дизайном исследования, которые помещались в одноразовые пробирки с транспортной средой и доставляли для изучения [Херрингтон С., Макги Дж., 1999]. Метод проведения ПЦР – диагностики включал последовательное проведение нескольких этапов:

Выделение ДНК из клинического материала. В подготовленный лизирующий раствор вносили по 10 мкл внутреннего контрольного образца (ВКО, если он был предусмотрен для анализа данного вида инфекции), затем по 100 мкл проб. В пробирку отрицательного контроля

(OK) выделения вносили 100 мкл отрицательного контрольного образца

(ОКО). Пробы тщательно центрифугировали и прогревали. В каждую пробирку добавляли ресуспендированый на центрифуге сорбент, еще раз перемешивали и оставляли на 5 мин. Сорбент осаждали центрифугированием, супернатант удаляли в колбу-ловушку. В пробы добавляли по 500 мкл растворителя для отмывки, перемешивали до

37

полного ресуспендирования сорбента и центрифугировали с последующим удалением супернатанта, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. Отмывку повторяли дважды – супернатант удаляли полностью. Пробирки помещали в термостат при t 65 °С на 5-10

минут для подсушивания сорбента, затем добавляли по 100 мкл ТЕ-буфера для эллюции ДНК. Перемешивали, вновь помещали в термостат при t 65 °С

на 5 минут, периодически встряхивая. Пробирки центрифугировали – супернатант содержал очищенную ДНК, пробы подготовлены к постановке ПЦР.

Постановка ПЦР. В работе были использованы ПЦР-тест-системы АмплиСенс-100-R (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ, г. Москва) для определения HPV 6/11, 16/18, 31/33, Chlamydia trachomatis, CMV-500, HSV-430 I,II, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum. В пробирки с ПЦР-смесью-1 и воском для амплификации вносили по 10 мкл ПЦР-смеси-

2, сверху добавляя по капле масла для ПЦР. В подготовленные для ПЦР пробирки под масло вносили 10 мкл ДНК, выделенной из клинических проб. Для контролей этапа ПЦР использовали отрицательный контроль (К- ) – в место ДНК-пробы вносили 10 мкл ДНК-буфера, и положительный контроль (К+) – вносили 10 мкл положительного контрольного образца ДНК (ПКО). Запускали на амплификаторе («MiniCycler», MJ Reseach)

соответствующую определяемой инфекции программу. После окончания реакции пробирки отправляли в комнату для анализа продуктов ПЦР.

Электрофоретический анализ продуктов амплификации. В

подготовленный рабочий электрофорезный буфер вносили агарозу, до полного растворения плавили в микроволновой печи, остужали до 65-70С.

В форму камеры для горизонтального электрофореза (SE-2, «Хеликон»)

заливали расплавленный гель, толщиной около 6 мм. После полного застывания подложку с готовым гелем помещали в камеру с расположением лунок ближе к отрицательному электроду. Из пробирок с

38

продуктами амплификации вносили по 10 мкл пробы в лунки геля.

Соблюдая полярность (ДНК движется к положительному электроду),

подключали камеру к источнику тока с напряжением 10 В/см геля. После прохождения красителем половины длины геля, источник тока выключали,

гель переносили на трансиллюминатор, получали изображение геля на компьютере с помощью видеосистемы, формировали базу данных.

Учет результатов. Учет результатов ПЦР-анализа проводился по наличию или отсутствию на электрофореграмме специфических полос амплифицированной ДНК. При проведении оценки результатов анализа,

проходящего с применением ВКО, учитывались следующие параметры:

в дорожке, соответствующей ОК этапа выделения, была только полоса ВКО;

в дорожке положительного контроля этапа ПЦР определялась только полоса К+;

в дорожке К этапа ПЦР не было никаких полос за исключением прайс-димеров, находящихся на уровне ниже 100 п.н.

При проведении учета результатов исследований, проведенных без применения ВКО, оценивались: в дорожке, соответствующей К+ этапа ПЦР, была яркая специфическая светящаяся оранжевая полоса на уровне фрагмента ДНК возбудителя; в дорожке ОК этапа выделения и К– этапа ПЦР не было никаких полос.

Положительными считались образцы, которые содержали специфическую светящуюся полосу большей или меньшей интенсивности на уровне фрагмента ДНК возбудителя.

Отрицательными – образцы, не содержавшие никаких полос.

Для проведения твердофазного иммуноферментного анализа определения антител класса IgG и IgM к антигенам ВПГ I, II типов и ЦМВ использовали стандартные коммерческие наборы реагентов компании

«Протеиновый контур» (г. Санкт-Петербург). При исследовании

39

иммуноглобулинов один тип моноклональных антител против ВПГ I, II

типов и ЦМВ иммобилизировали на внутренних поверхностях ячеек планшетов для микротитрования. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу молекул иммуноглобулинов применялся в виде конъюгата с биотином. Индикаторным компонентом реакции являлся конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином, имеющим высокое сродство к биотину. После стандартного режима инкубации образцов сыворотки крови с моноклональными антителами, и последующих промывок в лунки микропланшета вносили конъюгат пероксидазы со стрептавидином, вновь инкубировали, и добавляли субстрат с реагентом цветной реакции (3-диметиламинобензоат). После развития окраски измеряли активность связанной пероксидазы с использованием фотометра для микропланшета с длиной волны 450 нм. В качестве стандарта для сравнения в каждой реакции служили рекомбинантные образцы, входящие в состав наборов. По данным титрования стандартных образцов строили калибровочные графики, по которым определяли концентрацию иммуноглобулинов в опытных образцах [39].

2.3. Морфологическое и иммуноморфометрическое

исследование эндометрия

Морфологические и иммуноморфометрические исследования проводили в Московском городском центре патологоанатомических исследований при Городской клинической больнице № 14 им. проф. А.А.Остроумова и кафедре патологической анатомии Московского государственного медико-стоматологического университета (руководитель центра и зав. кафедрой – д.м.н., проф. О.В.Зайратьянц).

Материалом для исследования являлись биоптаты эндометрия, полученные в амбулаторных условиях при помощью аспирационной

40

кюретки Pipelle de Cornier (Франция). Из соскобов выбирали фрагменты эндометрия, фиксировали их в 10,0% растворе нейтрального формалина в течение 24 часов. Далее образцы тканей заливали в парафиновые блоки

(точка плавления 54-56°С), готовили микротомные срезы толщиной 5-7

микрон, которые после стандартных гистологических проводок окрашивались гематоксилином и эозином, а также пирофуксином по Ван Гизону. После гистологического просмотра препаратов отбирали блоки с париетальным и базальным эндометрием. Из отобранных блоков готовили серийные срезы, которые размещали на покрытых адгезивом стеклах.

При световой микроскопии микропрепаратов выявлялись изменения в пределах эндометрия и пограничных слоях миометрия. Особое внимание уделялось наличию в эндометрии воспалительных инфильтратов,

состоящих преимущественно из лимфоидных элементов с примесью макрофагов, наличию плазматических клеток, очаговому фиброзированию стромы, склеротическим изменениям стенок спиральных артерий.

Для иммуноморфологического исследования маркеров воспаления,

ангиогенеза, апоптоза, пролиферации клеток и рецепторов эстрогенов и прогестерона использовали иммунопероксидазный метод с применением первичных специфических моноклональных антител.

Гистологические срезы толщиной 4-5 мкм, изготовленные из парафиновых блоков с помощью микротома «Leica» (Germany) помещали на покрытые специальным адгезивом (APES-ацетон) предметные стекла.

Эндогенную пероксидазу в депарафинированных срезах блокировали 3%

перекисью водорода. Демаскировку антигенов производили по стандартной схеме, в микроволновой печи в течение 20 минут при 600В в

0,1 М растворе цитратного буфера (рH 6,0).

В качестве первичных антител для иммуногистохимического исследования использовали моноклональные антитела (производства

DAKO, Дания, Германии, Lab Vision, США) к фактору некроза опухолей