4 курс / Акушерство и гинекология / Ботвиньева_И_А_Иммунорегуляторные_белки_и_цитокины_при_беременности

42

Исследования выполнены в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения медицинских исследований с участием людей в качестве субъектов исследования». Всем пациенткам основной и контрольной групп в течение беременности проводились инструментальные и лабораторные исследования в соответствии с порядком оказания медицинской помощи по профилю «акушерство и гинекология» согласно приказа МЗ РФ №572н от 2012г.

Исследования полученных образцов биологического материала проводили на базе клинико-диагностической лаборатории МБЛПУ «Зональный перинатальный центр» г.Новокузнецка (директор к.м.н., Полукаров А.Н.), а также на базе научно-исследовательской лаборатории иммунологии (зав. лаб. д.б.н., проф. Зорин Н.А.) ГБОУ ДПО Новокузнецкого ГИУВа (ректор д.м.н., проф. Колбаско А.В.).

Отбор беременных женщин для участия в исследовании, а также получение образцов для исследования (венозная и пуповинная сыворотка, околоплодные воды) осуществлялся под руководством и при непосредственном участии заместителя директора по акушерству и гинекологии МБЛПУ «Зональный перинатальный центр», к.м.н., врача высшей квалификационной категории Ренге Л.В.

Также выражаем глубокую благодарность за помощь в наборе материала для исследований врачам клинического родильного дома МБЛПУ «Зональный перинатальный центр» г. Новокузнецка.

2.2. Методы получения образцов биологического материала

43

Для проведения лабораторных исследований полученные образцы венозной крови из локтевой вены в объеме 5,0 мл, помещали в пробирки, не содержащие антикоагулянт. Сыворотку крови отделяли центрифугированием в течение 20 минут при 1500 оборотах в минуту. Полученную коллекцию образцов хранили при температуре – 20º С в пластиковых пробирках типа «Eppendorf».

Взятие пуповинной крови осуществлялось при естественных родах после отделения ребенка от пуповины, как до рождения плаценты, так и после, в пробирки, не содержащие антикоагулянт. Обработку и хранение образцов проводили так же, как и для сыворотки крови матери.

Получение образцов околоплодных вод осуществлялось во время родов при самопроизвольном излитии. В случае попадания проводной крови в содержимое исследование данного материала не проводилось. Околоплодные воды перед проведением анализа соединяли с равным объемом фосфатносолевого буферного раствора, содержащего 0,1 % Тритона Х-100, и тщательно перемешивали (данные по консервации от ЗАО «Вектор-Бест», 15.11.2010г). Полученные препараты осветляли центрифугированием при 6000 оборотах в минуту в течение 5 минут. Надосадочную жидкость использовали для постановки анализа, полученный результат умножали на 2. Биологический материал хранили в таких же пробирках, как и сыворотку крови, в замороженном состоянии (при температуре -20 ºС).

2.3. Алгоритм лабораторного исследования

На первом этапе исследования, в образцах биологических жидкостей, полученных в 38-40 недель, определялись лабораторные показатели: альбумин,

СРБ, изучался цитокиновый профиль (TNF-α, IL-6, IL-8, IL-10, IL-18, INF-γ, IL1RА), а также содержание таких полифункциональных белковых компонентов

44

врожденного иммунитета как альфа-2-макроглобулин (а2-МГ) и лактоферрин (ЛФ), уровни иммунокомплексов а2-МГ-IgG. В сыворотке крови и пуповинной сыворотке были изучены все вышеперечисленные показатели, в околоплодных водах, в силу отсутствия технической возможности не и изучалось содержание СРБ.

На втором этапе, после предварительного анализа полученных результатов, для уточнения прогностических возможностей использования выявленных в родах предикторов ВУИ на более ранних сроках, была дополнительно исследована сыворотка крови беременных - носительниц IgG антител к Chlamydia trachomatis во II триместре (13-24 недель) и далее в родах (38-40 недель). Образцы сыворотки были проанализированы на наличие антител IgM, IgA и IgG к Ch. trachomatis, IgG антител к специфическим поверхностным антитегам Ch. trachomatis (MOMP + pgp3) и IgG антител к белку теплового шока (HSH 60), в них были определены концентрации лактоферрина.

2.4. Биохимические и иммунохимические методы исследований

Концентрацию альбумина в сыворотке венозной и пуповинной крови, околоплодных водах определяли колориметрическим методом с использованием реагента «бромкрезоловый зеленый» с помощью коммерческих тест-систем («Spinreact», Испания) и прилагающихся инструкций по проведению исследований. Измерение и обработка полученных результатов проводились при помощи автоматического биохимического анализатора

(«Konelab Prime 60i», Финляндия).

Уровни а2-МГ в сыворотке крови и пуповинной крови оценивались методом низковольтного ракетного иммуноэлектрофореза с использованием моноспецифических поликлональных кроличьих антисывороток против данных

45

белков (Зорин Н.А., 1983) и с увеличением длины канавки и расстояния между канавками для предотвращения смешивания образцов.

Для определения белков в околоплодных водах при необходимости использовались другие методы. В частности, для определения а2-МГ в ОВ была разработана иммуноферментная тест-система, описанная ниже.

2.5. Метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА)

Определение уровней всех изученных цитокинов, лактоферрина, С- реактивного белка, общих и специфических антител к Ch.trachomatis: IgM, IgA, IgG; IgG антител к специфическим антигенам поверхностной мембраны MOMP+ pgp3; антител к белку теплового шока HSH 60 определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тестсистем фирмы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск). При этом, для определения концентрации IL-6 и IL-8 сыворотку разводили в 50-100 раз забуференным физиологическим раствором, рH 7,8. Уровни TNF-α, IL-10, IL-18, INF-γ и IL1РА определяли в неразведенной сыворотке. Для определения ЛФ использовалось разведение сыворотки в 40 раз. Измерение и обработка всех результатов, полученных ИФА методом, проводились при помощи восьмиканального фотометра («Microplate Reader», model 3550, USA) с

использованием сертифицированной программы PC Microplate Manager/ PC Data Analysis Software («Bio-Rad», USA).

Для определения содержания а2-МГ в околоплодных водах и изучения уровней иммунокомплексов а2-МГ-IgG использовались сконструированные de novo исследовательстие тест-системы, но образцы разводились не в 2, а в 40 раз

(Зорина В.Н. и соавт., 2001)

2.6. Методы иммунопреципитации (иммуноэлектрофореза)

46

Количественный низковольтный ракетный имуноэлектрофорез (Веке Б., 1977) использовался для определения общих концентраций а2-МГ в образцах сыворотки крови. Иммуноэлектрофорез выполняли с помощью блоков питания и камеры для горизонтального электрофореза (Ирбис, Белоруссия). В качестве поддерживающей среды использовали легкоплавкую агарозу с mr ~0,1-0,15, температурой гелеобразования 30-40ºС и достаточной механической прочностью при формировании геля из 1% золя (Sigma, США; Serva, Германия). Гели формировали на стеклянных подложках. В качестве буферных сред применяли трис-трициновый буфер с рН 8,6 (Merrill E., Crowle A.J. 1982). Исследуемые образцы вносили в круглые или щелевидные канавки различной емкости, вырезанные в блоке геля. Электрофорез проводили без охлаждения гелей. Преципитаты окрашивали кумаси бриллиантовым синим R-250 (Bio-Rad, США).

2.7 Методы статистической обработки данных

Для статистической обработки полученных результатов использовали лицензионную версию сертифицированной РС программы для биостатистики

InStat 2.0 (Instat Biostatistics, Intuitive Software for Science (GraphPad, США).

Параметры, приводимые в работе: M – среднее, ±m – ошибка средней, n – объем анализируемой выборки, r – коэффициент корреляции, p – достигнутый уровень значимости. Для оценки индивидуальной вариабельности показателей помимо «m» изучалось SD – стандартное отклонение. Поскольку в литературных источниках отсутствуют нормативные данные по содержанию некоторых изученных показателей в пуповинной сыворотке и околоплодных водах, мы так же изучали 95% ДИ – доверительный интервал. Проверка нормальности распределения признаков проводилась с использованием критерия

47

Колмогорова-Смирнова. Парное межгрупповое сравнение показателей производилось по критерию Стьюдента либо при помощи непараметрического теста, корреляционный анализ проводился по критерию Пирсона (Pearson) или Спирмана (Spearman). Критическое значение уровня значимости – 0,05.

48

Глава 3. ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЕ БЕЛКИ И ЦИТОКИНЫ В КРОВИ РОЖЕНИЦ-НОСИТЕЛЬНИЦ IgG АТ К CHLAMYDIA TRACHOMATIS

Считается общепринятым, что осложнения хламидийной инфекции при беременности в значительной степени обусловлены локальной активацией синтеза цитокинов, часто приводящей к воспалению и преждевременным родам (Макаров О.В. и др., 2008). Однако, для реализации ряда эффектов, цитокины должны быть доставлены к клеткам-мишеням в комплексе с регуляторнотранспортным белком семейства макроглобулинов (Birkenmeier G., 2001). Кроме того, на синтез цитокинов активно влияет лактоферрин, обладающий выраженными антибактериальными свойствами (Legrand D., et al., 2005). В рамках данного исследования мы изучили содержание а2-МГ, иммунокомплекса а2- МГ-IgG и ЛФ в сравнении с уровнями ряда про-, противовоспалительных и иммунорегуляторных цитокинов, а также с уровнями «классических» реактантов воспаления (СРБ и альбумина) для уточнения их роли в иммунопатогенезе процессов, оказывающих негативное влияние на плод при носительстве антител к Chl. trachomatis.

3.1.Иммунорегуляторные белки в сыворотке крови рожениц с антителами

кChlamydia trachomatis

Содержание альфа-2-макроглобулина в крови рожениц (рис.2) было повышено при антителоносительстве только при рождении детей с неблагоприятным перинатальным исходом. При этом в группе женщин, имеющих IgG-антитела к Ch. trachomatis, родивших здоровых детей, оно было сопоставимо (95% ДИ: 2,48-2,96 г/л) с контрольной группой (2,40-2,83 г/л) и на 10 % ниже, чем в группе женщин, родивших детей с признаками внутриутробного инфицирования (2,74-3,17 г/л). При сравнении содержания а2-

49

МГ в сыворотке крови у подгрупп женщин-носительниц IgG-антител к Ch. trachomatis, статистически значимых различий между ними не выявлено.

2,9

2,8

2,72

2,7

2,61

2,6

2,5

2,4

Рис.2. Уровень а2-МГ (г/л) в сыворотке крови при беременности 38-40 недель у здоровых и у носительниц антител к Chlamydia trachomatis, в зависимости от состояния ребенка в раннем неонатальном периоде.

Таблица 1

Значения ошибка средней (±m) и стандартное отклонение (SD) при исследовании регуляторно-транспортных белков в сыворотке

крови в группах рожениц с IgG к Chlamydia trachomatis

Примечание: р1статистическая достоверность отличий от показателей в контроле; р2статистическая достоверность различий между показателями подгрупп антителоносительниц.

50

Индивидуальный разброс показателей во всех исследуемых группах был сопоставим (табл. 1). Концентрации а2-МГ более 3,5 г/л обнаруживались в 12 % в норме, в 21 % при антителоносительстве и рождении ребенка без клинических признаков инфицирования, а также в 25 % при наличии у новорожденного ПВИ. Уровни менее 2,0 г/л отмечены у 18 % в контрольной группе, у 27 % в подгруппе без ПВИ и у 12 % с ПВИ.

Изучение сывороточного содержания лактоферрина в родах (срок 38-40 недель) у антителоносительниц, и последующий ретроспективный анализ течения раннего неонатального периода, позволили установить, что содержание данного белка в сыворотке крови у рожениц – антителоносительниц было

Рис.3. Уровень ЛФ (мг/л) в сыворотке крови в родах (38-40 недель) у здоровых женщин и у носительниц антител к Chlamydia trachomatis, в зависимости от течения раннего неонатального периода.

При этом женщины, родившие здорового ребенка, имели в среднем повышенное на 22 % содержание ЛФ в сыворотке крови относительно