4 курс / Акушерство и гинекология / Ботвиньева_И_А_Иммунорегуляторные_белки_и_цитокины_при_беременности

21

макрофагами, что также может оказывать негативное влияние на течение и исход беременности (Abrahams VM. et. al., 2005, Fest S., et. al., 2007). В частности,

депрессия синтеза хемокинов снижает привлечение макрофагов, к тому же часть из них также подвержена заражению, их активация провоцирует развитие воспаления, негативно влияющего на плод (Torre E., et. al., 2009).

Хламидия разрушает субъединицы сигнальной NFκB, модулирующий синтез цитокинов и, в целом, ответ клеток трофобласта на патоген. IL-1β зависимая секреция IL-8 в культуре клеток подавляется при экспрессии протеиназоподобного хламидийного фактора активации CPAF (Christian J. et. al., 2010). При том, что NFκB является важным транскрипционным фактором при развитии иммунного ответа, его повреждение снижает способность клеток микроокружения к защите от патогенной инвазии и косвенно способствует усилению репликации хламидии. Возможно, данная протеолитическая активность возбудителя и позволяет «обманывать» иммунную систему заражаемого организма, способствуя распространению инфекции без выраженных проявлений ответной воспалительной реакции (Christian J., et. al., 2010).

Хламидийная инфекция индуцирует синтез IL-8 цервикальными эпителиальными клетками, но не через NFκB, а через MAPK сигнальные пути

(Chen F., et. al., 2010). Повышение уровней IL-8 позволяет авторам (Torre E., et. al., 2009) предположить, что негативное влияние на беременность и ее исход может вызывать инфильтрация тканей плаценты, реализуемая при активациии нейтрофилов. Этот цитокин индуцирует хемотаксис, активацию и дегрануляцию нейтрофилов, что приводит к высвобождению различных протеаз, в том числе коллагеназ. При беременности, осложненной амниальной инфекцией, этот процесс играет ключевую роль в трансформации шейки матки и преждевременном развитии родовой деятельности (Макаров О.В. и др., 2008,Макогон А.В. с соавт.,2011).

22

Ранее сообщалось (Osman I., et. al. 2003), что началу родов предшествует инфильтрация плаценты лейкоцитами и нарастание синтеза большинства провоспалительных цитокинов оболочкой плода, децидуальной оболочкой и шейкой матки, о чем свидетельствовало повышение уровня цитокиновых мРНК в биоптатах соответствующих тканей.

Известно, что Т-клеточный адаптивный иммунный ответ, индуцированный клетками антиген-представляющего комплекса (дендритными и пр.) также играет значительную роль в течение патологического процесса. Дендритные клетки способны продуцировать IL-12, инактивирующий возбудитель в экспериментах in vitro. В крови у женщин с нарушениями фертильности при хламидийной инфекции выше содержание плазмоцитоидных дендритных клеток, однако, в цервикальном канале их количество снижено, особенно при наличии осложнений. В цервикальных смывах при наличии осложнений значительно повышены уровни IL-6, IL-8, IL-10, IFN-γ. Авторы предполагают, что модуляция синтеза цитокинов определяет, произойдет ли хронизация процесса, сопровождающаяся нарушением фертильности и другими осложнениями (Winkler M., 2003, Agrawal T., et. al., 2008). Продемонстрировано, что

Chlamydia trachomatis дозозависимо индуцирует секрецию IL-8 и IL-10 в культурах клеток и этот гиперсинтез, в свою очередь, способствует ее активной репликации (Yu J.L., et. al. 2003, Hall JV, et. al. 2011). По последним данным, IL-6

может быть ключевым фактором при определении исхода хламидийной инфекции в плане нарушения репродуктивной функции. Его синтез в культурах эпителиальных клеток, в ответ на стресс-протеазы хламидии (chlamydial stress response proteases - CtHtrA, CtTsp) подвержен значительной индивидуальной вариабельности. Показано, что живая (но не убитая ультрафиолетом) хламидия подавляет синтез IL-6 (Cunningham K., et. al. 2013).

При изучении интерфероновой реакции лейкоцитов установлено, что способность к продукции IFN-α у беременных - носительниц урогенитальных

23

инфекций (не только Chl. tr.), родивших преждевременно, была выше, чем у здоровых беременных, а способность к продукции IFN-γ, напротив, была понижена (Макаров О.В., и др., 2011). В работах Srivastava P, и соавт (2012)

показано влияние пары антибиотиков на культуры инфицированных клеток от инфертильных и фертильных инфицированных женщин. Обнаружено ингибирование продукции IL-1β, IL-6, IL-8 и IL-10 при добавлении антибиотиков в культуры, эффекты при применении разных препаратов несколько различались. При этом, Th-17 –ассоциированные цитокины (IL-22, 23), согласно экспериментальным данным, в патогенезе не участвуют (Frazer L.C., et. al. 2013).

Так или иначе, заражение приводит к гиперсинтезу эпителиальными и иммунными клетками IL-1 и IL-18, а также каспазы первого типа, превращающей данные интерлейкины из предшественников в активную форму. Предполагается, что хламидии активируют мультипротеиновый комплекс

«инфламасому», содержащий ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation recruitment domain), через Nod-подобный рецептор

(NLR), активируют NFκB и MAPK сигнальные пути и, как следствие, стимулируют синтез провоспалительных цитокинов (Torre E., et. al., 2009).

Негативное влияние может оказать и гормональный статус женщины. Блокада эстрогеновых рецепторов подавляет развитие инфекции 2011). В крови у женщин с нарушениями фертильности при хламидийной

инфекции помимо выраженной экспрессии CD80, CD83, значительно выше содержание бета-эстрадиола, способного, как предполагают авторы, усиливать воспаление. Уровни эстрадиола коррелировали с СРБ, IL-6 и IFN-γ (Agrawal T., et. al., 2008). По крайней мере, в исследовании ЛПС-индуцированных культур клеток микроглии установлено, что эстрогены увеличивают синтез IL-10, и

подавляют продукцию TNF-α и IFN-γ (Dimayuga F.O., et. al. 2004).

Продемонстрировано влияние экзогенного прогестерона и эстрогенов на

24

инфицированные эпителиальные клетки (Wan C, et. al., 2013). Снижение TNF-α трудно оценить однозначно: с одной стороны, его избыточная концентрация может привести к серьезным повреждениям тканей, с другой – недостаточный уровень TNF-α может стать причиной ослабления неспецифического иммунного ответа. В свою очередь, IFN-γ способствует активации не только Т-хелперного, но и эффекторного звена иммунитета (макрофагов, натуральных киллеров и цитотоксических Т-лимфоцитов), а IL-10, наряду с активацией гуморального звена иммунной защиты организма, обладает мощным противовоспалительным и иммуномоделирующим эффектом (Ройт А., et. al. 2000).

Определенную, хоть и не вполне изученную с точки зрения последствий роль при ВУИ играют антитела и аутоантитела. В среднем, частота обнаружения антител к Ch. trachomatis у беременных по данным ВОЗ составляет 6-8%, но может достигать 37% в отдельных регионах. (Hueston W.J., Lenhart J.C. 1997). В своих работах Daponte A., и соавторы (2012) показали, что при эктопической беременности и выкидышах антитела к хламидиям обнаруживались в 35% случаев, при «нормальной» беременности – в 16%. Антитела класса G к Hsp 60 чаще выявлялись при эктопической беременности (43%), чем в контрольной группе (16%). Наличие антител к MOMP при эктопической беременности во всех случаях сопровождалось наличием антител к Hsp 60. Установлена высокая гомологичность хламидийного и человеческого Hsp 60, приводящая к перекрестным реакциям и синтезу аутоантител (Gammazza AM., et. al., 2012). Однако, по мнению других авторов, подобная гомология не является причиной развития аутоиммунных процессов, приводящих к бесплодию (Hjelholt A., et. al., 2011).

Было показано, что урогенитальные инфекции матери являются причиной длительной антигенной стимуляции иммунной системы плода, активации ее клеточных и гуморальных звеньев. Однако недостаточность эффекторных механизмов иммунного ответа плода приводит, в конечном счете, к развитию у

25

новорожденного иммунодефицитного состояния (Тареева Т.Г. и соавт., 2004;

Малиновская В.В., 1998.; Malinovskaya V.V., 1998).

Любопытно, что у части серопозитивных женщин с невынашиванием не выявлялся сам возбудитель. Baud D., и соавторы (2011) предполагают, что персистирующие антитела к возбудителю также могут взаимодействовать с антигенами эмбриона и оказывать на них негативное воздействие.

Заболеваемость новорождённых хламидийной инфекцией растёт пропорционально заболеваемости женщин репродуктивного возраста и беременных (Виноградова И.В., 2004).

Доказано, что инфицирование плода хламидиями происходит как внутриутробно (антенатально), так и при контакте с инфицированными родовыми путями во время родов (интранатально) (Казанцев А.П., Попова Н.И., 1980; Цинзерлинг А.В., 1989; Сидорова И.С., Черниенко И.Н., 1998; Shariat H. et. al., 1992; Sollecito D. et. al., 1992; Miller J.M., Martin D.H., 2000; Виноградова И.В.,2004).

По данным Евсюковой И.И. и соавт. (1997, 2000), пренатальная вероятность передачи хламидийной инфекции составляет 40-80%, Виноградовой И.В. (2004) - 40–70%, при этом 6-7% детей могут инфицироваться хламидиями при рождении. Наиболее часто развивается восходящая инфекция из нижних отделов мочеполовых органов с инфицированием околоплодных вод и развитием хориоамнионита. Аспирация или заглатывание инфицированных ОВ ведёт к инфицированию лёгких, пищеварительного тракта плода с развитием инфекционного процесса ещё до рождения ребёнка. Это может происходить как при преждевременном разрыве плодных оболочек, так и при интактных оболочках, например при рождении ребёнка путём операции кесарева сечения

(Виноградова И.В., 2004).

При исследовании содержания цитокинов в околоплодных водах и сыворотке крови у детей с ВУИ были получены противоречивые данные. Так, в работах Кулакова В.И. и соавт. (2005) у детей с ВУИ в ОВ выявлены

26

достоверно повышенные уровни IL-1β и TNF-α, содержание IL-10 неизменно. В работах Бахаревой И.В. (2009) – наблюдается повышение уровня IL-12, достоверное снижение IFN-γ и недостоверное снижение IL-1β. На достоверное снижение IFN-γ в околоплодных водах на фоне отсутствия изменений в сыворотке крови при риске развития ВУИ указывала Ганковская Л.В. с соавт. (2008). Макогон А.В. с соавт. (2011) обнаружили у беременных с ВУИ не только достоверное снижение содержания IFN-γ в ОВ и в сыворотке крови, но и достоверное повышение уровня IL-1RA в околоплодных водах и в сыворотке крови, а также достоверное повышение уровней TNF-α и IL-6 в ОВ и IL-6, IL-8 в крови беременных. В работах Болотских В.М. (2012), напротив, в околоплодных водах не было получено данных, отличающихся от контроля, однако были достоверно повышены уровни TNF-α и IL-8 в сыворотке крови. Подобная противоречивость данных, вероятно, объясняется высокой индивидуальной вариабельностью уровней цитокинов.

Известно, что высокая противовоспалительная активность околоплодных вод - физиологическая норма, а одним из важнейших факторов устойчивости плодного яйца к воздействию воспалительных агентов является IL-6 (Robertson S.A., 2006). Ранее даже было предложено использовать IL-6 в ОВ в качестве маркера внутриутробного инфицирования плода (Kuzanovic J.P., et. al., 2008). Считается, что провоспалительные цитокины IL-1β и TNF-α не способны преодолеть плацентарный барьер, но способствуют более интенсивному транспорту IL-6 через плаценту (Zaretsky M.V., et. al. 2004). При амниальной инфекии бактериальной этиологии концентрация IL-8 возрастает не только в плазме беременной и в цервикальном секрете, но и в плаценте (Winkler M., 2003).

Развитие воспалительного ответа и степень выраженности заболевания зависит от уровней экспрессии как про-, так и противовоспалительных цитокинов, которая детерминирована генетически (Макогон А.В. с соавт., 2007). В своих работах Speer E.M. и соавторы (2006) описали некоторые полиморфные

27

варианты генов IL-1, TNF-α, IL-10, которые обуславливают синтез провоспалительных цитокинов в избыточной концентрации при недостаточной экспрессии противовоспалительных цитокинов, что ведет к развитию амниальной инфекции и преждевременным родам. В работах Ломовой Н.А. с соавт. (2013) получены данные о наличии у ребенка генотипа А/А полиморфизма гена IL-10: -592 который ассоциируется с повышением вероятности внутриутробной инфекции при плацентарной недостаточности.

Вцелом, хламидийная инфекция в периоде новорожденности отличается полиморфизмом клинических проявлений и отсутствием специфических симптомов. При этом все классические внутриутробные инфекции (хламидиоз, цитомегалия, герпес, краснуха, токсоплазмоз и др.) имеют сходную клиническую картину и характеризуются развитием гипотрофии, синдрома дыхательных расстройств, гепатоспленомегалии, желтухи, кардиопатии, неврологическими нарушениями (Малкова Е.М., и др., 2001). Однако более чем у 90% инфицированных детей сразу после рождения отсутствуют симптомы заболевания (Анохин В.А., Хасанова Г.Р., 2000), а отсроченная патология у детей, инфицированных внутриутробно, остается наиболее малоизученной проблемой.

Всвязи с разнообразием форм хламидийной инфекции у беременных, существуют сложности в их диагностике (Виноградова И.В., 2004, Флакс Г.А., и др.,

2009).

Основные методы обнаружения хламидиоза - выделение возбудителя в культуре клеток; прямая иммунофлуоресценция (ПИФ); молекулярнобиологические методы: ДНК-гибридизация, полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени, NASBA в реальном времени и др., иммуноферментный анализ (ИФА).

К традиционным методам диагностики хламидиоза относят выделение хламидий в культуре клеток. Это классический способ выявления Сh. trachomatis, незаменимый при диагностике персистирующей инфекции (Флакс Г.А., и др.,

28

2009). Посев на клеточные культуры более специфичен, чем ПИФ, незаменим при определении излеченности хламидиоза, так как другие методы могут давать искажённые результаты. Недостаток данного метода заключается в том, что он требует много времени (от 42 до 72 часов), специального лабораторного оснащения и, как результат, стоимость его выше по сравнению с другими методами диагностики, к тому же чувствительность метода остаётся низкой — в

пределах 40–60% (Hajikhani B, et. al., 2013).

ПИФ-метод относительно прост и доступен практически любой лаборатории. Чувствительность и специфичность метода зависят от качества используемых моноклональных люминесцирующих АТ, однако количество ложноположительных результатов может быть достаточно велико.

Методы амплификации нуклеиновых кислот (ПЦР) высокоспецифичны и чувствительны, могут быть использованы для скрининга, особенно для исследования клинических материалов, полученных неинвазивным путём. В случае диагностики хламидиоза у инфертильных женщин пытаются использовать даже менструальные ткани (Michou I.V., et. al., 2013). Этот метод не требует сохранения жизнеспособности возбудителя, однако необходимо следовать строгим требованиям к условиям транспортировки клинического материала, несоблюдение которых может существенно исказить результат анализа. Специфичность метода, при соблюдении всех стандартов GMP, достигает 100%, чувствительность — 98%. В соответствии с Рекомендациями CDC, Европейским руководством по ведению пациентов с инфекцией, вызванной C.trachomatis, и Протоколами ведения больных «Инфекции, передаваемые половым путем» только ПЦР-диагностика может быть рекомендована для обнаружения Ch.trachomatis. Новый и перспективный метод

— NASBA (Nucleic Acid Sequence-based Amplification) в реальном времени позволяет определить жизнеспособного возбудителя и заменить метод культивирования. Материалом для диагностики являются соскобы из

29

цервикального канала и уретры. Однако при хронической инфекции, особенно при персистенции возбудителя, часто имеются ложноотрицательные результаты. Установлено, что при сальпингоофоритах хламидии из цервикального канала выделяются в 14% случаев. В то же время у 70% больных с трубно-перитонеальной формой бесплодия обнаруживаются антихламидийные антитела в сыворотке (Михнина Е.А., 2012).

На сегодняшний день «золотым стандартом» диагностики урогенитальной инфекции являются сочетание культурального метода и метода ПЦР (Флакс Г.А., и др., 2009). Однако, взятие образцов на анализ при беременности повышает риск выкидыша и без того высокий при хламидиозе. Прямые методы диагностики ВУИ, с применением ПЦР и культурального метода для выявления возбудителя в материале, полученном при биопсии хориона, амниоцентезе, кордоцентезе точны, но достаточно травматичны (Виноградова И.В., 2004).

Помимо выявления антигена, в диагностике ВУИ часто используют определение антител к возбудителю. Так, иммуноферментный анализ, редко используемый для обнаружения антигена, часто применяется для определения IgM, IgA, IgG антител к хламидийным антигенам, что особенно важно для диагностики хламидиоза при восходящей инфекции. Данный метод часто применяется для оценки инфицированности матери на различных сроках беременности. При оценке ИФА результатов в неонатальном периоде необходимо учитывать, что общие и специфические IgG в первый месяц жизни ребенка, как правило, имеют материнское происхождение вследствие пассивного переноса через плаценту. Период полураспада материнских иммуноглобулинов составляет 21 день. Диагностически значимым считают обнаружение нарастания титра IgG в 4 раза при исследовании парных сывороток крови. Отсутствие прироста уровня данных антител не позволяет исключать внутриутробного инфицирования. IgM относятся к белкам острой фазы заболевания, не переносятся трансплацентарно и могут определяться в

30

крови новорожденных при интранатальном инфицировании. При пренатальном инфицировании острая стадия инфекционного процесса у плода может развиться до наступления родов, в таком случае IgM в сыворотке крови не обнаруживаются.

Необходимо отметить, что ИФА-метод выявляет не сам возбудитель, а определяет выраженность ответной реакции гумморального иммунитета на инфекцию. При этом сами хламидии — слабые иммуногены, поэтому титры антител при хламидиозах относительно невысоки (Михнина Е.А., 2012). Информативность ИФА снижается в неонатальном периоде в связи с относительным иммунодефицитом у новорожденных. Евсюкова И.И. с соавт. (2000) указывает на отсутствие антихламидийного гуморального ответа в связи с недостаточной антигенной стимуляцией при персистирующей форме инфекции у детей 7-9 лет. Специфичность ИФА часто снижается из-за антигенных перекрестов между белками различных возбудителей, между белками возбудителей и собственно клеточными белками. Чувствительность иногда оказывается недостаточной для обнаружения антигенов с низким уровнем продукции. У новорожденных детей продукция антител к определенным антигенам может отсутствовать или носить необычный характер

(Малкова Е.М. и соавт., 2001).

Микроиммунофлуоресцентные методы используются реже и, как и ИФА, имеют ограниченную диагностическую ценность.

Для увеличения чувствительности и специфичности малоинвазивных ИФА-диагностических тестов при выявлении Ch.traсhomatis в последнее время предлагается комплексное исследование нескольких показателей (Bas.S., et. al., 2001) к примеру, схема обследования, включающая определение IgG антител к: MOMP (главный белок наружной мембраны Ch. trachomatis, составляющий 60% от всех белков наружной мембраны), pgp 3 (мебранно-ассоциированный, иммунозначимый белок, кодирующийся общей плазмидой), HSP 60 (белок