60. Методы изучения генетики человека.
Генеалогический метод предполагает построение родословных и прослеживание в ряду поколений передачи определенного признака.
Метод позволяет установить:
является ли признак наследственным (по проявлению его у членов родословной);
тип наследования (доминантный или рецессивный, аутосомный или гоносомный);
гомо- или гетерозиготность анализируемого пациента;
частоту проявления гена;
вероятность рождения ребенка с наследственной патологией.
Генеалогический анализ – это поэтапный процесс. Сначала собираются данные у пробанда (лица, с которого начинается обследование семьи) обо всех родственниках обследуемого (анамнез). Затем строится, анализируется родословная. На последнем этапе делают выводы.
При построении родословных руководствуются следующими условными обозначениями (по Юсту, 1932 г.):
При помощи генеалогического метода устанавливают типы наследования признаков:
Аутосомно-доминантный. При таком типе наследования признак встречается в каждом поколении, болеют в равной степени люди обеих полов, признак наследуется по вертикали и горизонтали, вероятность наследования составляет 100% (если один из родителей гомозиготен), 75% (если оба родителя гетерозиготны) и 50% (если один родитель гетерозиготен, а второй – гомозиготен по рецессивному признаку). Признаки аутосомно-доминантного проявляются при полном доминировании и 100%-ной пенетрантности гена.
Аутосомно-рецессивный. Особенности наследования признака: встречается не в каждом поколении; больной (гомозиготный) ребенок рождается у здоровых (гетерозиготных) родителей; заболевают в равной степени мужчины и женщины; наследуется обычно по горизонтали; вероятность наследования 25% (при гетерозиготности родителей), 50% (если один родитель гетерозиготен, а второй гомозиготен по рецессивному признаку) и 100% (у рецессивных гомозиготных родителей).
Х-сцепленный рецессивный. В этом случае признак также встречается не в каждом поколении, болезни затрагивают, как правило, мужчины, больной ребенок рождается у здоровых родителей, признак наследуется чаще по горизонтали, вероятность наследования – у 25% всех детей, в том числе у 50% мальчиков (при гетерозиготной матери и здоровом отце).
Голандрический. При таком типе наследования признак может проявиться в любом поколении, болеют только мужчины, заболевают все сыновья больного отца, вероятность наследования у мальчиков 100%.
Основной недостаток генеалогического метода – нехватка подробных родословных.
Близнецовый метод предложил в 1876 г. Ф. Гальтон. Такой подход к изучению генетики человека основан на установлении роли наследственности и среды в формировании признаков, исходя из сходства и различия моно- и дизиготных близнецов.
Суть метода: составляется выборка близнецов с последующей диагностики их зиготности близнецов; определяется степень конкордантности выборок близнецов по изучаемому признаку; рассчитывается коэффициент наследования.
Близнецы бывают моно- и дизиготными. Первые берут свое начало из одной яйцеклетки, которая была оплодотворена одним сперматозоидом вследствие явления полиэмбрионии. Генотипы таких близнецов одинаковы, но фенотипы могут розниться, причиной чему служат разные факторы внешней среды. Дизиготные близнецы развиваются после оплодотворения разными сперматозоидами нескольких одновременно созревших яйцеклеток. Генотипы и фенотипы близнецов разняться. При этом фенотипические различия обусловлены как генотипом, так и внешними факторами.
У монозиготных близнецов обычно сходны признаки, зависящие от генотипа. Например, у них совпадает половая принадлежность, группы крови независимо системы, цвет глаз, дерматоглифические узоры на пальцах, ладонях и стопах, состав нуклеотидов в ДНК. Эти признаки служат критериями диагностики зиготности близнецов. Различие хотя бы по одному из этих критериев свидетельствует о дизиготности близнецов.
Сходство близнецов по изучаемому признаку – это конкордантность, а различие – дискордантность.
Роль наследственности и среды в развитии того или иного признака определяется по формуле Хольцингера:
Н= (КМБ – КДБ) / (100% – КДБ) (1)
где: Н – коэффициент наследования; КМБ – процент конкордантных монозиготных близнецов в изучаемой группе; КДБ – процент конкордантных дизиготных близнецов.
Чем ближе результат к 1, тем сильнее наследственность влияет на степень проявления признака, и наоборот, чем ближе результат к 0, тем больше роль средовых факторов.
Цитогенетический метод – это изучение кариотипа путем ее микроскопирования. Последовательность этапов: клетки культивируются (обычно лимфоциты) на искусственной питательной среде; фитогемагглютинином (ФГА) стимулируется митоз; посредством добавления колхицина на стадии метафазы останавливается митоз; клетки обрабатываются гипотоническим раствором; окрашиваются хромосы; микроскопируется и фотографируется кариотип; строится и анализируется идиограмма.
В этот метод изучения кариотипа человека интегрированы специальные программы на ЭВМ, распределяющие хромосомы по группам, анализирующие их и выдающие заключение.
Возможности метод:
выявление геномных (например, синдрома Дауна) мутаций;
выявление хромосомных (например, синдрома «кошачьего крика») мутаций.
Форма записи кариотипа пациента:
общее количество хромосом;
набор гетерохромосом;
номер хромосомы, короткого или длинного плеча;
избыток (+) или нехватка (–) генетического материала.
Наибольшей разрешающей способностью обладает метод флуоресцентной in situ-гибридизации (FISH), при котором специфический меченный флюорохромами зонд гибридизируется с комплементарным участком ДНК (если имеется) прямо на цитологическом препарате. Этот метод дает возможность выявлять генную активность ДНК и РНК и, соответственно, уточнять структуру, топографию и морфологию хромосом (локализацию гена) и ставить точный диагноз наследственной патологии.
Разновидность FISH-анализа – SKY-анализ (spectral karyotyping) – спектральное кариотипирование (24-цветное флуоресцентное окрашивание хромосом), которое было разработано в 1996 г. для диагностики маркерных хромосом, межхромосомных и геномных мутаций.
Методы генетики соматических клеток сделали возможным изучение многих вопросов генетики человека в эксперименте. Обычно культивируются клетки соединительной ткани (фибробласты) и лимфоциты крови.
Искусственные питательные позволяют клонировать соматические клетки, а также получать потомство одной клетки. Идентичность генотипов всех потомков делает возможным изучение роли генотипа и среды в проявлении признаков на клеточном уровне.
Также доступна селекция (отбор) клеток с заранее заданными свойствами на селективных питательных средах.
В частной генетике человека чаще прибегают к гибридизации клеток – слиянию соматических клеток в культуре. Такое спонтанное слияние происходит довольно редко. Частоту гибридизации клеток можно повысить за счет введения в культуру клеток РНК-содержащего вируса парагриппа Сендай, инактивированного ультрафиолетом. В смешанной культуре разных типов клеток образуются гетерокарионы – клетки, в цитоплазме которых содержится по два ядра разных видов. Морфологические, биохимические свойства таких клеток являются промежуточными между исходными родительскими клетками.
После митоза из двуядерного гетерокариона образуются две одноядерные клетки, каждая из которых представляет собой синкарион – настоящую гибридную клетку, содержащую хромосомы обеих родительских клеток. В данном случае можно говорить об объединённом генотипе.
Гибридизация свойственна как клеткам одного, так и клеткам разных видов, например, человека и мыши. Второй вариант гибридизации используется при определении группы сцепления у человека, а также выяснении последовательности расположения генов (построении генетически карт хромосом человека).
Биохимические методы – это изучение активности ферментных систем либо по активности самого фермента, либо по количеству конечных продуктов реакции, катализатором которой служит данный фермент. В генетике человека используют хроматографические, флюорометрические, радиоиммунологические и некоторые другие методы. Каждый из них служит для выявления генных мутаций, являющихся причинами болезней обмена веществ.
Молекулярно-генетические методы позволяют анализировать фрагменты ДНК, находить и изолировать отдельные гены и их сегменты, устанавливать в них последовательность нуклеотидов и обнаруживать патологические гены в геноме.
В эту группу методов изучения генетики человека входят:
метод клонирования ДНК;
метод гибридизации нуклеиновых кислот.
Метод клонирования ДНК служит для изолирования отдельных генов или их фрагментов, имеющих точки узнавания. Для этих целей используются ферменты рестриктазы.
При методе гибридизации нуклеиновых кислот преследуются следующие задачи: установление порядка нуклеотидов в молекуле ДНК; обнаружение единственного гена среди десятков тысяч.
В медицинской генетике нашли практическое применение методы моделирования, основанные на использовании биологических объектов или математических подходов.
Биологическое моделирование проводится на мутантных линиях животных с патологиями, которые имеются и у человека. Пример: и у мышей, и у человека встречается несращение губы и неба.
Мутантные линии животных не дают точной картины наследственных болезней человека. В то же время даже их частичное воспроизведение в ряде случаев позволяет выявить механизмы первичного отклонения от нормы и разработать соответствующие методы диагностики, профилактики и лечения.
Теоретической основой для биологического моделирования служит закон гомологичных рядов наследственной изменчивости Н.И. Вавилова: генетически близкие виды и роды характеризуются сходными рядами наследственной изменчивости.
Сегодня этот метод чаще используют для изучения мутагенного и тератогенного действия новых лекарств до их клинического испытания.
Математическое моделирование – это метод, используемый при создании и изучении математических моделей популяций живых организмов. Также при помощи этого метода рассчитываются частоты генотипов, изучаются их динамика по причине изменений внешних воздействий окружающей среды (последствия аварии на ЧАЭС). Математические методы применимы в тех случаях, когда другие подходы неэффективны.
Популяционно-статистический метод основан на использовании закона Харди-Вайнберга. К нему прибегают, когда есть необходимость в изучении частоты генов и генотипов в популяциях людей.
Зная распространение генов среди населения различных географических зон (геногеография) можно установить центры происхождения различных этнических групп и их миграцию. Метод может использоваться и с диагностическими целями, так как позволяет определить степень риска появления наследственных патологий у отдельных индивидуумов, проживающих в определенных странах (регионах).