Практическая+иммунодиагностика+2020

Способы применения туберкулиновых проб с диагностической целью разрабатывали в СССР П.С. Медовиков, Н.Н. Гринчар и Д.А. Карпиловский [23], при помощи чего определяли у детей и взрослых уровень сенсибилизированных к белкам МБТ Т-лимфоцитов. При помощи внутрикожной туберкулиновой пробы Манту с 2 ТЕ определяли первичное инфицирование МБТ. Из последующих работ с туберкулином стало очевидным, что выраженная гиперемия при кожных реакциях в части случаев неспецифическая и обусловлена содержанием в альттуберкулине белка питательной среды и коллоидных продуктов распада бактерий. Перед исследователями встала задача изготовления очищенного препарата, лишенного аллергизирующих свойств.

В последующие годы была отработана методика изготовления туберкулина, которая обеспечивала отсутствие в препарате посторонних примесей. В 1934 году F. Seibert, J. Aronson, J. Rachel, J. Darkand, Е. Long впервые получили ту-

беркулин, свободный от посторонних примесей и лишенный сенсибилизирующих свойств, и назвали его Purified Protein Derivative (PPD). Этот препарат характеризовался высокой биологической активностью, стабильностью и не обладал сенсибилизирующими свойствами. Продолжая работать над совершенствованием очистки туберкулина, F. Seibert (1941) использовала для этой цели сульфат аммония, позволивший очистить препарат и уменьшить его денатурацию.

Препарат высушивали методом лиофилизации. Полученный этим способом очищенный туберкулин получил название Purified Protein Derivative Seibert (PPD-S) и в 1952

году был утвержден ВОЗ в качестве международного стандарта сухого очищенного туберкулина для млекопитающих. За международную единицу было принято количество туберкулина, которое можно вводить без опасения вызвать у испытуемых контингентов слишком сильные реакции и которое способно выявить 80–90% положительных реакций у инфицированных туберкулезом лиц. В 1965 году принято весовое

11

отношение, которое содержит 0,00002 мг чистого препарата и 0,000008 мг буферных солей. Этот эталон туберкулина хранится в Копенгагенском государственном институте сывороток (Дания) и в США.

ВСССР группа ученых под руководством М. А. Линниковой в 1939 году опубликовала сообщение о получении первых экспериментальных серий сухого очищенного туберкулина [20]. Она же предложила готовить туберкулин из вытяжки микобактерий бычьего штамма, имеющих до 90% совпадений по набору антигенов с вакцинным штаммом. То есть диагностикум содержал до 200 антигенов, полученных из МБТ-штаммов humanus и bovis, которые присутствовали

вдругих видах МБТ, в том числе bovis BCG. Этот факт ограничивал использование туберкулина для дифференциальной диагностики инфекционной и поствакцинной аллергии.

С 1954 года в СССР было налажено производство очищенного туберкулина в порошке, названного Purified Protein Derivative Линниковой (PPD-L). Преимуществом его перед АТК были высокая специфичность и стерильность готовых для употребления необходимых разведений растворов. Проблема была в том, что в растворе из-за сорбции вещества стеклом терялась активность препарата тем сильнее, чем слабее была концентрация туберкулина. Работа по стандартизации отечественного туберкулина осуществлялась под руководством Т.Б. Яблоковой в Государственном контрольном институте им. Л.А. Тарасевича. Результаты, полученные в эксперименте, и клинические испытания позволили выработать национальный стандарт и установить, что весовое соотношение международного стандарта PPD-S и национального стандарта PPD-L равно 1:3. При таком соотношении достигался эквивалент полного аллергического ответа инфицированного МБТ организма на введенный туберкулин.

В1958 году К. Magnus и другие с целью стабилизации туберкулина предложили добавлять 0,005% р-р твина 80. Твин 80 – это полиоксиэтиленовое производное моноолеи-

12

новокислого сорбитана–детергента (поверхностно-активное вещество), препятствующего адсорбции активного начала туберкулина стеклом ампулы. Т. Б. Яблокова установила, что действие твина 80 проявляется как в усилении внутрикожной реакции по размеру и по плотности, так и в более ярком ее характере, так как твин 80 задерживал рассасывание активного вещества туберкулина в месте его введения, что увеличивало количество положительных реакций. В1965 году Государственным контрольным институтом им. Л. А. Тарасевича разработана новая, современная модификация стабилизированного очищенного туберкулина в растворе. Полученный с использованием разработанной методики раствор туберкулина был стабилен и не терял необходимых для него свойств. Этот препарат был сразу внедрен в практику противотуберкулезной службы.

Наличие недостатков туберкулиновых проб заставляло исследователей искать новые способы диагностики туберкулеза на ранних этапах. Для этих целей применяли диагностикум эритроцитарный антигенный сухой (ДЭАС) и тест-систему иммуноферментную для определения антител к возбудителю туберкулеза (ИФА). ДЭАС использовался как иммунологический тест для определения активности процесса и эффективности лечения. Проблема аллергических реакций стояла всегда, хотя не так остро, как в современном обществе. Поэтому большие надежды возлагались на определение противотуберкулезных антител у пациентов с аллергопатологией [21, 43, 47].

В конце XX века при помощи ИФА определяли уровень антител разных классов (IgG, IgE) для диагностики и установления активности туберкулеза, в том числе с внелегочной локализацией [15, 47]. Чувствительность иммуноферментного анализа для определения титра антител при туберкулезе составила 60−70%, а специфичность − около 90%, что не позволяло использовать тест-систему для скрининга туберку-

леза [21].

13

В1996 году Андерсеном были открыты 2 белка (ESAT-6

иCFP-10), находящихся в части генома (RD1), которым различаются виды МБТ [48] (рис. 1). Этот участок гена имеется у Mycobacterium tuberculosis humanis и потерян в процессе культивирования и 233 пересевов Mycobacterium bovis для создания Mycobacterium bovis BCG-штамма. Открытые два белка (ESAT-6 и CFP-10) стали использовать для диагностики туберкулезной инфекции. На моделях зараженных туберкулезом животных установлено, что экспрессия белков ESAT-6 и CFP-10 связана именно с процессом размножения

Mycobacterium tuberculosis [12, 16].

Рис. 1. Строение гена ДНК МБТ и ДНК микобактерии bovis BCG штаммов [16]

В результате многолетней работы влаборатории биотехнологии НИИ молекулярной медицины ММА им. И. М. Сеченова совместно с ЗАО «Мастерклон» под руководством академика РАН М. А. Пальцева [13, 16] был создан новый реагент для кожного теста с аллергеном туберкулезным рекомбинантным, получивший название «ДИАСКИНТЕСТ» (diприставка, обозначающая «дважды» (лат.), skin–кожа (англ.), test–тест (англ.) – аллерген туберкулезный рекомбинантный (АТР) в стандартном разведении представлял собой рекомбинант-

14

ный белок, продуцируемый генетически модифицированной культурой Escherichia coli BL21(DE3)/p CFP-ESAT, разведенный в стерильном изотоническом фосфатном буферном растворе,

сконсервантом (фенол). Действие препарата АТР основано на выявлении клеточного иммунного ответа на специфические для Mycobacterium tuberculosis антигены (ESAT 6, CFP 10) [14, 16]. При внутрикожном введении АТР вызывал у лиц

стуберкулезной инфекцией специфическую кожную реакцию, являющуюся проявлением ГЗТ.

При помощи кожного теста с АТР выявляли сенсибилизированные к этим белкам Т-лимфоциты. Положительные результаты кожной ГЗТ определялись при наличии инфицированностиМБТ(humanis)инедавалиреакцииувакцинированных БЦЖ. Клинические испытания показали, что препарат не обладал сенсибилизирующим действием, не токсичен, безопасен, чувствителен, специфичен в отношении вирулентных штаммов МБТ [16, 17]. Неспецифическая аллергия при его введении отсутствовала, а гиперергические реакции наблюдались в 2−14% случаев [12]. У контактных лиц реакция на введение АТР носила более выраженный характер в виде гиперергической реакции, в том числе с лимфангоитом, а также с везикуло-некротическими изменениями [18, 38].

Тест с АТР использовали не только в детском возрасте, но и у взрослых при подозрении на туберкулезную этиологию заболевания, в том числе у лиц с ВИЧ, получающих терапию иммунодепрессантами и ГИБП [34].

Применение теста с АТР у лиц с ВИЧ позволило улучшить качество дифференциальной диагностики туберкулеза и микобактериоза; туберкулеза и нетуберкулезного поражения органов человека [13]. Отмечалось, что стадии ВИЧ-ин- фекции в большей степени влияли на результаты кожных тестов при проведении пробы Манту с 2 ТЕ ППД-Л и в меньшей степени − при использовании теста с АТР [51].

За рубежом открытие двух белков (ESAT-6 и CFP-10) еще в конце ХХ века повлекло за собой создание современ-

15

ных диагностических тестов на основе ИФА. Отличием стало исследование уровней цитокинов, а не антител. Изучали концентрацию γ-IFN (QuantiFERON-TB) или Т-лимфоцитов (T-SPOT.TB), способных продуцировать этот цитокин при взаимодействии с описанными белками.

Классификация иммунологических тестов представлена на рис.2.

Развитие научно-технического прогресса создало предпосылки к дальнейшему углубленному изучению возбудителя туберкулеза. Расшифровка генотипа МБТ позволила выявить наличие региона RD1 c белками ESAT-6, CFP-10. Это открытие легло в основу создания и внедрения в практику инновационных методов диагностики туберкулеза in vitro, in vivo наряду с применением кожного теста с туберкулином. У каждого теста имеется своя ниша в клиническом применении.

17

ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА

ПРИФОРМИРОВАНИИТУБЕРКУЛЕЗНЫХГРАНУЛЕМ

По данным А.А. Воробьева, гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) проявляется в 3 вариантах: грану-

лематозном, туберкулиновом и контактном [10]. При ту-

беркулезной инфекции итогом ГЗТ является формирование гранулемы и туберкулиновой чувствительности при диагностике или некоторых проявлениях внелегочных локализаций туберкулеза [22]. Проникновение МБТ в организм человека происходит чаще всего в детском возрасте аэрогенным (более 90% случаев) или алиментарным (не более 5–10%) путя-

ми [25].

При аэрогенном механизме передачи инфекции из здоровогоорганизмаудаляетсяприпомощиэлементовврожденного иммунитета до 90-95% возбудителя. К ним относят реснитчатый эпителий верхних дыхательных путей, являющийся первым барьером для продвижения МБТ, и фагоцитирующие клетки (уδТСR-клетки), находящиеся в слизистой кольца Пирогова – Вальдейера. В результате этого в легочную ткань проникает небольшое количество возбудителя. Дошедшие до нижних отделов легких МБТ встречаются альвеолярными макрофагами. Исходом этой встречи может и должно быть полное уничтожение инфекционного агента. В случаях повторного попадания МБТ в организм при повторных и/или продолжительных контактах с больным, выделяющим МБТ, альвеолярные макрофаги могут не справиться с возбудителем туберкулеза, в результате чего создадутся предпосылки к развитию заболевания, распространению МБТ с током крови по организму (рис. 3).

18

Рис.3. Этапы формирования туберкулезной инфекции

19

При этом включается приобретенный иммунитет и из периферическогокровяногоруславыходятнаиболеедревние фагоциты – нейтрофилы. Эти клетки не специализированы для противостояния с МБТ и погибают, образуя казеозные массы (на рис. 4 – зеленый цвет), передавая эстафету моноцитам с рецепторами CD14+ на своей поверхности, которые, приходя в ткани, становятся макрофагами [36] (см. рис. 4).

МБТ проникают внутрь макрофага через несколько рецепторов. Причем, сигналы, получаемые клеткой с одних рецепторов, могут оказывать существенное влияние на функцию других рецепторов и даже внутри одной группы рецепторы могут различаться по степени взаимодействия с антигенами возбудителя [10, 36]. На макрофагах имеются рецепторы для фибрина и продуктов его деградации, способствующие более тесному взаимодействию клеток с продуктами свертывания [36]. Вот почему при инфекционном процессе, в том числе туберкулезном воспалении, происходит «сгущение» крови.

При развитии туберкулеза условно выделяют две фазы: острую и хроническую [41]. Отличает их активность возбудителя МБТ в организме, время, прошедшее с момента угасания острых воспалительных реакций, что сопровождается разным набором цитокинов.

Острая фаза сходна с ранним воспалительным неспецифическим ответом, но отличается тем, что макрофаги исходно активируются не микробными продуктами, а INF-γ и другими цитокинами [41]. Чтобы стать макрофагом, моноцит из кровяного русла должен проникнуть в ткань за счет активированных лимфоцитов и выработки ими TNF-α и др. [41]. То есть чем большее количество моноцитов превратится в макрофаги, тем большее их количество будет обнаруживаться в ткани и тем обширнее будет барьер, ограничивающий возбудителя туберкулеза (на рис.4 − розовый цвет).

Макрофаги захватывают МБТ, распознают их антигенную структуру, перерабатывают информацию об антигенах

20