Пищевая Биохимия / Дроздова Е.А. Микрофлора продовольственного сырья и продуктов его переработки

Впоследствии они разрушаются в процессе хранения и пастеризации молока.

Пестициды обычно обнаруживаются в молоке в концентрациях, не оказывающих влияние на развитие молочнокислых бактерий. Остатки моюще-дезинфицирующих средств редко бывают причиной торможения молочнокислого брожения, если мойка и дезинфекция оборудования проводятся правильно. Они могут попадать в молоко лишь при нарушениях процесса мойки или в целях фальсификации.

Продукты обмена микроорганизмов, развивающихся в молоке, найдены в

10 % образцов сильно обсемененного молока. Эти ингибиторы разрушаются при нагревании до 83 °С. Обнаружены также термостойкие ингибиторы,

вырабатываемые микрококками и грамотрицательными палочками.

Наибольшую роль в снижении гигиенического качества молока играют антибиотики. В ветеринарии для лечения животных используют пенициллин,

стрептомицин, тетрациклин, бацитрацин и другие антибиотики. Одним из наиболее опасных антибиотиков при производстве кисломолочных продуктов считается пенициллин, так как он термоустойчив и не разрушается при кратковременной пастеризации. Для лечения заболеваний вымени применяют антибиотики дозой от сотен тысяч до нескольких миллионов международных единиц пенициллина или других антибиотиков отдельно или в комбинации. После лечения вымени антибиотики или сульфаниламиды обычно выделяются с молоком, по крайней мере,

в течение 6 доений. Поэтому в ветеринарной практике разработаны требования,

ограничивающие сроки сдачи молока после лечения коров антибиотиками и сульфаниламидами. Только после окончания срока от 48 до 72 ч после окончания лечения можно сдавать молоко на переработку.

Антибиотики могут также попадать в молоко при поедании коровами кормов,

предназначенных, например, для свиней, в которые антибиотики специально добавляются. Кроме того, антибиотики, применяемые в ветеринарии, иногда обнаруживаются в молоке как результат фальсификации.

Содержание антибиотиков в молоке регламентируется в разных странах в зависимости от чувствительности метода, применяемого для их определения.

191

Основными мерами для исключения попадания в молоко ингибирующих

веществ являются следующие:

1)правильное обращение с антибиотиками и другими лечебными препаратами при лечении заболеваний коров (особенно маститов);

2)соблюдение сроков, запрещающих сдачу молока от животных,

подвергнутых лечению антибиотиками;

3)пресечение неконтролируемого применения антибиотиков и других лечебных препаратов;

4)информирование молочных предприятий о медикаментозном лечении коров и исключение поставок молока при подозрении на наличие в нем ингибирующих веществ;

5)предотвращение дачи кормов, содержащих антибиотики;

6)соблюдение требований при использовании средств уничтожения насекомых;

7)обеспечение правильной мойки и дезинфекции доильного оборудования и оборудования для первичной обработки молока, исключение возможности попадания в молоко моюще-дезинфицирующих веществ;

8)систематический контроль молока на наличие ингибирующих веществ при его приемке предприятиями молочной промышленности.

6.3 Методы количественного учета микроорганизмов

6.3.1 Метод непосредственного учета клеток

С помощью микроскопа в препарате из анализируемого субстрата подсчитывают количество видимых клеток, как мертвых, так и живых. Этот метод простой, позволяет быстро получить результаты, а, следовательно, оценить исследуемый образец. Недостатком метода является невозможность отличить живые клетки от мертвых, нельзя получить микробы в виде культур и исследовать их

192

свойства, следовательно, при непосредственном подсчете невозможно осуществлять качественное исследование микроорганизмов.

Существует несколько вариантов метода непосредственного подсчета микробов под микроскопом. При некоторых из них, например подсчете в камерах,

учитывают клетки непосредственно в жидкости; в других, например методе Брида,

Дрейера – Королева, микроскопируют высушенный, фиксированный и окрашенный препарат. Имеется также вариант (метод микрокультур), представляющий как бы сочетание метода непосредственного подсчета микробов с методом культивирования.

6.3.1.1 Подсчет клеток в счетной камере

Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло, в середине которого находится плоское углубление; расстояние от его дна до нижней поверхности покровного стекла, плотно наложенного на края впадины, равно

0,1 мм. В центре дна счетной камеры нанесена квадратная сетка общей площадью

1 мм2, состоящая из 400 квадратиков (20 × 20). При величине элементарного квадратика 1/400 мм2, толщине слоя (глубине камеры) 0,1 мл объем каждого столбика жидкости, расположенного на элементарном квадратике, равен 1/400 мм2.

Небольшую каплю исследуемой жидкости, предварительно тщательно взболтанной, вносят петлей в центр камеры и покрывают ровным стеклом, с

которым капля должна соприкасаться верхней поверхностью. Покровное стекло слегка нажимают возле краев, немного передвигают до тех пор, пока не будет достигнуто полное прикосновение. Камеру устанавливают на столик микроскопа,

оставляют на несколько минут в покое, пока все клетки не осядут на дно, и

устанавливают систему микроскопа так, чтобы было видно отчётливое изображение основной сетки камеры и исследуемых клеток (дрожжей или бактерий).

193

Подсчитав количество клеток в нескольких квадратиках, находят среднее число клеток для одного квадратика. Если в среднем на один квадратик приходится

2 клетки, то в 1 мл будет находиться от 4 × 106 до 8 × 106 клеток.

6.3.1.2 Метод Брида

Точно калиброванной пипеткой 0,01 мл исследуемой жидкости помещают на предметное стекло и равномерно распределяют профламбированной иглой на площади 1 см2. Мазок высушивают, обезжиривают, фиксируют и окрашивают. Для одновременного обезжиривания, фиксирования и окрашивания препарата рекомендуется следующий состав раствора: спирт абсолютный – 50 мл, хлороформ

– 50 мл, ледяная уксусная кислота – 20 мл, фуксин основной – 0,1 г, метиленовый голубой – 1,0 г.

Спирт предварительно обезвоживают желатином. Краски растворяют в смеси спирта и хлороформа, нагретой до 50 °С. После охлаждения до комнатной температуры в раствор добавляют ледяную уксусную кислоту.

Препарат готовят обычным способом и высушивают на воздухе без подогрева и фиксации на пламени. Затем его обезжиривают, фиксируют и окрашивают,

дважды погружая в указанный выше раствор (первый раз на 5 с, второй – на 10 с).

Бактериальные клетки окрашиваются в синевато-голубой цвет и четко выделяются на ярко-розовом фоне. Клетки подсчитывают, пользуясь иммерсионным объективом, в определенном количестве типичных полей зрения, затем вычислением определяют среднее количество бактерий в одном поле зрения.

194

6.3.2 Методы учета микроорганизмов путем культивирования

6.3.2.1 Чашечный метод

Сущность метода заключается в посеве определенного количества исследуемого субстрата или его разведения в чашки Петри с плотной питательной средой, на которой после термостатированния (в зависимости от видов организмов)

подсчитывают выросшие колонии.

На результат подсчета микроорганизмов с помощью этого метода влияет целый ряд факторов: состав и рН питательной среды, температура и продолжительность термостатирования. Для получения сравнимых результатов при учете определенных групп микроорганизмов нужно применять среды стандартного состава.

С помощью этого метода можно подсчитать количество микроорганизмов различных групп в зависимости от используемых питательных сред и условий термостатирования.

Исходя из предполагаемой обсемененности исследуемого продукта, готовят разведения для посевов. При небольшом количестве микробов (100-300 клеток в

1 мл) исследуемый образец не разводят, а засевают 1 мл непосредственно в чашку Петри и заливают питательной средой. Если микрофлора исследуемого материала обильная, то приготавливают разведения, причем рассчитывают, какое из разведений должно быть последним, чтобы в результате посева 1 мл этого разведения на чашке Петри находились десятки колоний.

6.3.2.2 Метод подсчета микроколоний

В стерильную пробирку наливают 1 мл расплавленного и охлажденного до

45 °С от 2 % до 3 % тщательно отфильтрованного агара и 1 мл исследуемого

195

материала. 0,5 мл тщательно перемешанной смеси наносят на предметное стекло и распределяют на площади 8 см2 (предметное стекло слегка подогревают, а границы площади отмечают по шаблону).

Через 1 или 2 мин после нанесения мазка предметное стекло помещают во влажную камеру, для этого используют эксикаторы или чашки Петри с дистиллированной водой (крышку слегка приоткрывают). Посевы выдерживают при

30 °С в течение 6 ч, затем подсушивают при 45 °С (в термостате). Высушенный мазок окрашивают в течение 2 или 3 с слабым раствором (1:9) метиленового голубого также, как и обычный мазок. Краску смывают, препарат высушивают и просматривают с масляной системой. При окуляре × 4, объективе 90 и длине тубуса

160 мм площадь поля зрения будет равна 0,0553 мм2.

Для упрощения расчета количество микроколоний в одном поле зрения умножают на 57800. Полученное число умножают еще на разведение и получают количество клеток в 1 мл или 1 г продукта.

6.3.2.3 Посев в жидкие среды (метод предельных разведений, метод титрования)

В пробирки (или колбы) с жидкой средой вносят строго определенный объем из различных разведений исследуемого продукта. После инкубации регистрируют наличие или отсутствие роста, результаты обрабатывают статистически с помощью специальной таблицы и затем рассчитывают число клеток, содержащихся в 1 г

(1 мл) исходного субстрата.

Питательную среду, благоприятную для развития учитываемых микроорганизмов, предварительно разливают в пробирки или колбы и стерилизуют.

Во все пробирки наливают одинаковый объем среды, посев проводят из нескольких разведений с таким расчетом, чтобы в опыт попало то разведение, при высеве из которого рост будет во всех параллельных сосудах, а также то последующее разведение, которое не даст роста ни в одной из параллельных пробирок. Каждое

196

разведение засевают в 2-5 параллельных пробирок, начиная с большего разведения.

Количество посевного материала во всех пробирках одинаково и соответствует 1 мл.

После инокулирования среды пробирки выдерживают при температуре,

благоприятной для роста микроорганизмов.

После инкубации отмечают наличие или отсутствие роста микроорганизмов по характерным для данной группы признакам: визуально – по свертыванию,

кислотообразованию, помутнению, газообразованию. Затем по таблице Мак-Крэди,

разработанной на основании методов вариационной статистики, определяют наиболее вероятное количество микроорганизмов.

Рассмотренные методы учета микроорганизмов имеют свои достоинства и недостатки. Так, при простоте определения и быстром получении результатов по методу подсчета клеток в счетной камере (методу Брида) следует учесть, что результаты могут иметь завышенные значения, так как при этих методах определяется суммарное количество микробов – и мертвых, и живых.

Чашечный метод отличается от предыдущих длительностью анализа, но с помощью этого метода можно выявить количество жизнеспособных клеток. Метод предельных разведений также характеризуется продолжительностью анализа и,

кроме того, большим разбросом показаний. Но при этом он позволяет определить микробную обсемененность в больших количествах исследуемого продукта (1 г и более).

6.4 Микробиология питьевого молока

Основные технологические процессы производства питьевого молока и сливок: нормализация, пастеризация, гомогенизация, промежуточное хранение,

розлив, хранение в упаковке до реализации, нормализация и гомогенизация могут способствовать вторичному обсеменению молока и сливок, если они проводятся после пастеризации.

197

6.4.1 Влияние пастеризации на микрофлору молока

Степень уничтожения микроорганизмов в процессе пастеризации зависит от следующих факторов: исходного количества микроорганизмов в сыром молоке,

температуры и продолжительности нагревания; видового состава сапрофитной микрофлоры сырого молока; правильной эксплуатации пастеризационно-

охладительных установок.

6.4.1.1 Исходное количество микроорганизмов

Отмирание микроорганизмов под влиянием высоких температур является временным процессом.

Эффективность пастеризации (в процентах) выражается отношением количества уничтоженных клеток к содержанию клеток в исходном сыром молоке.

Чем выше количество микроорганизмов в сыром молоке, тем больше их остается после пастеризации.

6.4.1.2 Температура и продолжительность нагревания

При выборе режимов пастеризации необходимо максимально сохранить пищевую и биологическую ценность молока и уничтожить все неспорообразующие патогенные микробы и большую часть технически вредных микроорганизмов.

Разрушение фосфатазы происходит при несколько более жестких режимах,

чем гибель патогенных бактерий. Поэтому принято определять гигиеническую надежность пастеризации по отсутствию в молоке щелочной фосфатазы. Для инактивации фосфатазы в сливках 20 %-ной и 40 %-ной жирности требуется повысить температуру пастеризации на 1 °С по сравнению с температурой

198

пастеризации, необходимой для инактивации фосфатазы в цельном молоке при той же длительности процесса.

Существуют и другие режимы тепловой обработки молока, которые имеют свои преимущества и недостатки. Так, молоко от здорового поголовья целесообразно пастеризовать при температуре от 71 °С до 72 °С и выдержке от 15

до 45 с. В этом случае сохраняются полезные кислотообразующие бактерии,

которые являются антагонистами спорообразующих бактерий. При сильном обсеменении сырого молока (больше 106 в 1 мл) эффективность пастеризации снижается. Если молоко сильно обсеменено, применяют более жесткий режим пастеризации: температура от 75 °С до 77 °С и выдержка от 15 до 35 с. В этом случае повышается эффективность пастеризации (при отсутствии термостойких бактерий), инактивируется липаза, предотвращается прогоркание молока. Однако при таком режиме могут погибать и полезные кислотообразующие бактерии. При хранении молока происходит его сладкое свертывание, и оно становится непригодным в пищу.

Режим от 75 °С до 76 °С с выдержкой от 15 до 20 с более надежно гарантирует гигиеническую безопасность молока в случае возможного наличия в сыром молоке вируса ящура, шигелл Зонне, коагулазоположительных стафилококков и бактерий группы кишечной палочки.

6.4.1.3 Правильная эксплуатация пастеризационно-охладительных установок

Основное внимание при проведении процесса пастеризации должно быть обращено на правильную эксплуатацию установок и контроль за их работой.

Обслуживание и контроль работы приборов и средств автоматизации пластинчатых пастеризационно-охладительных установок необходимо проводить в соответствии с требованиями действующей инструкции. Весь процесс работы пастеризационно-охладительных установок фиксируется на диаграммах, случаи

199

падения температуры в процессе пастеризации должны отмечаться аппаратчиком на диаграмме или в специальном журнале.

Датчик температуры пастеризации, управляющий клапаном возврата недопастеризованного молока, устанавливают после секции пастеризации перед выдерживателем, а сам возвратный клапан – после выдерживателя. Проверять работу возвратного клапана необходимо ежедневно, записывая результаты в журнал. Для отбора проб при контроле эффективности пастеризации на выходе из секции охлаждения должен быть установлен кран.

После заполнения резервуаров пастеризованным молоком его проверяют пробой на фосфатазу. Такой проверке подвергают ежедневно молоко во всех резервуарах с обязательным занесением результатов анализа в специальный журнал.

Контроль за работой пастеризационно-охладительных установок должен осуществляться постоянно службой контрольно-измерительных приборов, контроль правильности ведения процесса пастеризации по диаграммам и результатам микробиологического исследования и химических анализов (проба на фосфатазу) –

работниками лабораторий.

6.4.2 Изменение микрофлоры пастеризованного молока в процессе производства

Микрофлора пастеризованного молока и сливок складывается из микрофлоры,

оставшейся после пастеризации (остаточной), и микрофлоры, обсеменяющей молоко на последующих этапах производства. Количество бактерий, попадающих в молоко после пастеризации, составляет от 84,5 % до 94,9 % общей микрофлоры молока в упаковке. Характер изменения микрофлоры пастеризованного молока в процессе производства показан в таблице 6.8.

200