2.Практическая часть
Опыт№1 «Биуретовая реакция на пептидную связь»
Биуретовый метод — один из колориметрических методов количественного определения белков в растворе.
Основан на образовании биуретового комплекса (имеет фиолетовый цвет) пептидных связей белков с двухвалентными ионами меди. В методе используют т. н. биуретовый реактив, состоящий из KOH, CuSO4 и цитрата натрия (или тартрата натрия). В образовавшемся комплексе медь связана с 4 азотами координационными связями, а с 2 кислородами — электростатическими. Полноценный комплекс образуется лишь с пептидами, состоящими более чем из 4 остатков. Оптическую плотность раствора (прямо пропорциональную концентрации пептида) определяют при 540—560 нм.
К достоинствам метода стоит отнести его низкую чувствительность к посторонним веществам, невысокую погрешность.
Чувствительность метода — 2-10 мг/мл.
Выполнение работы:
Наливаем 5 капель белка из колбы в пробирку ,затем добавляем туда 3 капли 10% NaOH и 1 каплю 1% CuSO4, перемешиваем раствор. Мы видим, что раствор поменял цвет, он стал сине-фиолетовый.
Объяснение:
NaOH, сильное основание (щелочь). Бесцветные кристаллы, с сильным разогреванием растворяется в воде.
Сульфат меди(II) (CuSO4) — медная соль серной кислоты, белые кристаллы, хорошо растворимые в воде. Растворимость сульфата меди(II) по мере роста температуры .Как и все соли, образованные ионами слабого основания и сильной кислоты, сульфат меди(II) гидролизуется, и даёт кислую среду .
Эта реакция является универсальной для всех белков, так как она открывает наличие не менее двух пептидных связей, с помощью которых соединяются между собой аминокислоты, входящие в белки, и формируют его первичную структуру. В основе биуретовой реакции лежит способность пептидных связей (CO-NH-) в щелочной среде образовывать с сульфатом меди окрашенные комплексные соединения, цвет которых зависит от длины полипептидной цепи. Раствор белка (нативного) дает сине-фиолетовое окрашивание, а продукты его гидролиза (пептиды) - красно-фиолетовый цвет.
Опыт№2 «Ксантопротеиновая реакция»
(Реакция нитрирования)
Ксантопротеиновая реакция, цветная качественная реакция (появление жёлтого окрашивания), которую дают растворы белка при кипячении с концентрированной азотной кислотой. После добавления концентрированной щёлочи жёлтое окрашивание переходит в оранжевое. Реакция указывает на присутствие ароматических аминокислот(фенилаланина, тирозина и триптофана) и обусловлена образованием их нитропроизводных.
С помощью этой реакции открываются в белке циклические аминокислоты, имеющие в своем составе бензольное кольцо триптофан, фенилаланин и тирозин. Реакция обусловлена нитрованием бензольного кольца при участии концентрированной азотной кислоты. При добавлении концентрированной азотной кислоты появляется белый осадок, который при нагревании почти полностью растворяется и раствор приобретает желтый цвет.
Выполнение работы:
Наливаем 5 капель белка из колбы в пробирку ,затем добавляем туда 4 капли концентрированной азотной кислоты . Потом осторожно кипятим этот раствор. Мы видим что в начале образуется белый осадок свернувшегося белка( под влиянием кислоты) , который при нагревании окрашивается в желтый цвет ,а затем растворяется(происходит гидролиз белка).
Затем мы охлаждаем данный раствор . Потом добавляем в него 10% NaOH, вследствие этого появляется оранжевое окрашивание (из-за образования натриевой соли динитротирозина).
Объяснение:
Азо́тная кислота́ (HNO3), — сильная одноосновная кислота.
Высококонцентрированная HNO3 имеет обычно бурую окраску вследствие происходящего на свету процесса разложения:
При нагревании азотная кислота распадается по той же реакции.
NaOH, сильное основание (щелочь). Бесцветные кристаллы, с сильным разогреванием растворяется в воде.