Бактерископические методы исследования
Работа № 1. Техника приготовления и окрашивания фиксированных препаратов
Цель: изучить структуру клеточной стенки.
Самостоятельная работа:
а
)
приготовить мазок из смеси культур
стафилококка (посев на МПА) и кишечной
палочки (посев на МПА). Окрасить
генцианвиолетом (простой метод).
Зарисовать.
Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
б) приготовить мазок из смеси культур стафилококка (посев на МПА) и кишечной палочки (посев на МПА). Окрасить фуксином водным (простой метод). Зарисовать.
Результат:_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
в) приготовить мазок из смеси культур стафилококка (посев на МПА) и кишечной палочки (посев на МПА). Окрасить по Граму (сложный метод). Зарисовать.
Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Работа № 2. Техника приготовления препаратов в нативном виде
Цель: изучить характер подвижности микроорганизмов в препаратах «раздавленная» капля.
Самостоятельная работа: в темнопольном и фазово-контрастном микроскопе изучить характер подвижности сенной и водного вибриона. Зарисовать, описать.
А) Б)
А) Водный вибрион (Vibrio)
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Б) Кишечная палочка (Escherichia coli)
________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Теоретическая справка
1. ПРИГОТОВЛЕНИЕ МАЗКА. При приготовлении мазка с плотной питательной среды на обезжиренное предметное стекло нанести петлей небольшую каплю физиологического раствора. В правую руку взять бактериологическую петлю, в левую - пробирку с культурой. Прожечь петлю, внося ее в пламя горелки в вертикальном положении. После того как петля накалится докрасна, провести конец петледержателя через пламя. Вынуть пробку из пробирки, захватив ее мизинцем правой руки. Обжечь на спиртовке края пробирки. Внося петлю в пробирку, охладить ее, касаясь стенок пробирки. Затем петлей с поверхности среды снять очень небольшое количество культуры. Не касаясь стенок пробирки, вынуть петлю, еще раз обжечь края пробирки над спиртовкой и закрыть ее пробкой. Захваченную петлей культуру внести в приготовленную ранее каплю физиологического раствора, хорошо размешать и равномерно распределить по стеклу в виде небольшого круга или овала (1-1,5см в диаметре). По окончании приготовления мазка вновь прожечь петлю.
Для приготовления мазка из бульонной культуры на предметное стекло нанести 1-2 петли исследуемого материала и равномерно распределить по стеклу. При изготовлении мазков из культуры с жидкой питательной средой или из эмульсии микробов не требуется использование физиологического раствора. С обратной стороны стекла карандашом по стеклу записать шифр препарата и обвести мазок.
2. ВЫСУШИВАНИЕ МАЗКА. Высушивание мазка производится на воздухе. Для ускорения высушивания предметное стекло с мазком, обращенным кверху, подержать в струе теплого воздуха, высоко над пламенем спиртовки, не внося препарат в пламя.
3. ФИКСАЦИЯ МАЗКА. После полного высушивания - фиксация мазка. Для этого стекло с мазком, обращенным кверху, медленно провести через пламя 3-4 раза. При этом микроорганизмы погибают, мазок прикрепляется к стеклу и не смывается при дальнейшей обработке. Окрашиваемость препарата после фиксации улучшается.
4. ОКРАСКА МАЗКА. После охлаждения предметного стекла произвести окраску препарата. На мазок нанести несколько капель водного раствора фуксина так, чтобы весь мазок был покрыт краской. Водным фуксином окрашивать в течение 1-2 мин. Смыть краску водой, просушить препарат фильтровальной бумагой. Каплю иммерсионного масла можно наносить только на сухой мазок.
Для изучения тинкториальных свойств микроорганизмов (отношение к красящим веществам) и их морфологии используют анилиновые красители (основные, кислые, нейтральные). Наибольшее применение имеют основные краски: метиленовый синий, основной фуксин, генцианвиолет, метиловый фиолетовый, кристаллический фиолетовый.
Окраска микроорганизмов имеет большое диагностическое значение, так как дает возможность установить морфологические и тинкториальные особенности микроба, чего в некоторых случаях достаточно для постановки микробиологического диагноза. Окраска микроорганизмов представляет собой сложный физико-химический процесс, в механизме которого существенную роль играют явления адсорбции, капиллярности, химического сродства между красителем и окрашиваемым объектом и рН среды, в которой они находятся.
Методы окраски:
Простые (используется один краситель):
-метиленовый синий - окраска в течение 3-5 мин;
-генцианвиолет - окраска в течение 1-2 мин;
-фуксин водный - окраска в течение 1-2 мин.
Простыми методами окраски пользуются для обнаружения в микроскопируемом материалемикробов, определения их количества, формы и расположения.
Сложные ( используется несколько красителей):
-окраска по методу Грама;
-окраска по Нейссеру;
-окраска по методу Бурри-Гинса и др.
Метод окраски по Граму (сущность)
Отношение бактерий к окраске по Граму определяется их способностью удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс генцианового фиолетового и йода. У грамположительных бактерий основным веществом клеточной стенки (до 90%) являются мукопептиды-муреин (пептидогликан). У грамотрицательных бактерий однослойный муреин располагается в глубине клеточной стенки, значительно больше содержится белков и липидов, которые вместе с полисахаридами образуют поверхностные слои в виде мозаики, их цитоплазма содержит РНК и ДНК в соотношении 8:1 и 1:1 соответственно. Кроме того, проницаемость клеточной стенки у грамположительных бактерий меньше, чем у грамотрицательных. Это объясняется большим содержанием мукопептида в составе клеточной стенки грамположительных бактерий и меньшим диаметром пор, что способствует удержанию образовавшегося комплекса при обработке бактерий этиловым спиртом.
Методика окраски (алгоритмы приготовления мазков и окраски препаратов находятся в аудиториях).
Фиксированный мазок окрашивают генциановым фиолетовым 1-2 мин. через полоску фильтровальной бумаги.
Снимают пинцетом бумагу. Не промывая препарата водой, сливают краситель и наносят раствор Люголя на 1 мин до почернения.
Сливают раствор Люголя, не промывая водой, погружают препарат в стаканчик с 96°спиртом на 20-30 с. Обесцвечивание производят до отхождения фиолетовых струй красителя.
Препарат тщательно промывают водой для удаления спирта.
Докрашивают препарат фуксином Пфейффера в течение 1-2 мин. Краситель смывают водой, препарат высушивают и микроскопируют при помощи иммерсионной системы.
Грамположительные микробы окрашиваются в фиолетовый цвет, грамотрицательные -в красный (розовый).
Методы, используемые для изучения нативных препаратов.
Метод «раздавленной» капли. На поверхность обезжиренного предметного стекла наносят каплю исследуемого материала или суспензию бактерий и покрывают ее покровным стеклом. Капля должна быть небольшой, не выходящей за край покровного стекла. Микроскопируют препарат с объективом 40х.
Метод «висячей» капли. Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной культуры. Затем предметное стекло с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. В правильно приготовленном препарате капля должна свободно висеть над лункой, не касаясь ее дна или края. Для микроскопии вначале используют сухой объектив 8х, под увеличением которого находят край капли, а затем устанавливают объектив 40х и исследуют препарат.
Прижизненная (витальная) окраска. Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового синего или нейтрального красного. Затем готовят препарат «висячая» или «раздавленная» капля и микроскопируют. После микроскопии препараты «висячей» или «раздавленной» капли опускают в дезинфицирующий раствор.
Подпись преподавателя_________________________________________________________
ЗАНЯТИЕ №3. Морфология бактерий (продолжение)
Работа №1. Постоянные структуры бактериальной клетки. Метод изучения кислотоустойчивых бактерий
Цель: изучить структуру клеточной стенки кислотоустойчивых бактерий.
Самостоятельная работа: микроскопировать готовый препарат- мазок микобактерий туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), окрашенный по методу Циля-Нильсена. Зарисовать, описать.
СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ
Результат:___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Вывод:__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
Теоретическая справка
МЕТОД ОКРАСКИ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ БАКТЕРИЙ. Кислотоустойчивость обусловлена наличием в клеточной стенке бактерий повышенного количества липидов, воска, и миколовой кислоты. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает её тинкториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливает реакцию взаимодействия красителя с бактериальными клетками, которые окрашиваются в красный цвет. Таким образом при обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окрашенными фуксином в красный цвет.