Примеси (impurities)

В проекте схемы очистки важно рассмотреть, какие примеси должны быть удалены и до какой степени. Для диагностики, например, может быть приемлемым уровень чистоты 95%. Для терапии, однако, уровни чистоты вообще должны превышать 99%. Для очистки терапевтического фактора VIIIc, log снижение ключевых примесей - фибриногена, фибронектина и фактора VIII:RAg – происходило на каждом этапе очистки. Этап иммуноаффинной хроматографии давал наивысшую очистку, но с колонки «стекали» следовые количества мышиных MAbs. Поэтому дополнительно был использован этап ионообменной хроматографии, чтобы привести загрязнения антителами к уровню меньше чем 10 нг на единицу фактора.

Частицы

Частицы, клеточные фрагменты и целые клетки могут быть удалены фильтрованием или центрифугированием. Однако, «осветление» и преципитация могут быть объединены в один этап двухфазным разделением, адсорбцией, «бэтч-методом», «EBA» или использованием очень больших бусинок сорбента, которые позволяют проскок частиц. Принимая во внимание, что двухфазные методы подходят для обработки очень больших объемов, «EBA» обеспечивают удобный формат, например «закрытый контейнер» обработки опасных материалов. «EBA» показала хорошее удаление живых клеток по сравнению с центрифугированием.

Протеолитические ферменты

Присутствие протеолитических ферментов может решительно уменьшать извлечение из-за деградации продукта. Иногда возможно добиться инактивации протеолитических ферментов и стабилизации продукта за счет регулирования pH.

Если этого невозможно добиться, то адсорбция или продукта, или протеолитических ферментов должна быть выполнена настолько быстро, насколько возможно, и предпочтительно в условиях, при которых продукт останется устойчивым, а протеолизис будет минимизирован. Однако, иммобилизованные ферменты часто более устойчивы, чем в растворе, и если подача РЦП продолжается через колонку, продукт может быть разрушен иммобилизованными протеолитическими ферментами. Активность протеолитических ферментов может быть снижена добавлением протеолитических ингибиторов (но это беспокойство по валидации) или понижением температуры. Конечно, наиболее правильная стратегия состоит в том, чтобы предотвратить протеолитическую активность уже на стадии ферментации.

Нуклеиновые кислоты

Высокое содержание НК увеличивает вязкость. Обработка ДНКазой или РНКазой эффективно уменьшит вязкость, но добавит один дополнительный contaminant, который будет удален на последующих этапах. Использование анионообменника в присутствии умеренно высокой концентрации соли в большинстве случаев приведет к связыванию НК без связывания белков. НК отрицательно заряжены, адсорбция продукта на катионообменнике, гидрофобном или аффинном сорбенте приведет к эффективной очистке. Другие методы для удаления НК кислот включают преципитацию полиэтиленимином, хлоридом магния или сульфатом стрептомицина.

Липиды

Липиды могут забивать фильтры и хроматографические сорбенты и, таким образом, нарушать хроматографический процесс очистки. Липиды задерживаются (2-3 объема колоны) адсорбцией на Sephadex, который используется для делипидизации плазмы. Как альтернатива, первым хроматографическим шагом мог бы быть тот, который позволяет связывать продукт в то время, когда примесь проскакивает, например ионообменная или аффинная хроматография. Липиды могут также быть удалены осаждением сульфатом декстрана.