Лекция 15.

Проект очистки, оптимизация и масштабирование (продолжение) принципы очистки

Хроматографическое разделение молекул основано на физическом и химическом взаимодействии интересующей нас молекулы и хроматографической среды. Такое взаимодействие может быть обусловлено размерами молекулы (гель-фильтрация - GF); отрицательно или положительно заряженными группами, которые экспонированы на поверхности молекулы (ионообменная хроматография - IEC); эффектом растворофобности лиофильных групп на поверхности молекулы (хроматография на обращенных фазах – RPC, хроматография гидрофобного взаимодействия - HIC); специфическим ориентационным взаимодействием (аффинная хроматография - AC) или другими типами взаимодействий (например, переносом заряда, ароматическими, гидрофильными и т.д.) между поверхностями. Поскольку биомакромолекулы обладают несколькими из этих поверхностных свойств, можно ожидать, что хроматографическое разделение будет происходить в основном под влиянием нескольких механизмов взаимодействия, хотя в большинстве случаев моно будет с уверенностью сказать, что превалирует какой-то определенный механизм.

Рис. 1. Общее извлечение продукта как функция его выхода на отдельных этапах: 95, 90, 85 и 80 %.

Механизм, то есть принцип разделения, зависит от свойств молекулы, которая будет очищена и примесей, которые будут удалены. Вообще, принцип или область множества методов разделения, которые дадут возможность достичь самой высокой избирательности между целевой молекулой и примесями (с сохранением функциональными свойств целевой молекулы) приведут к процессу очистки, имеющему минимум этапов разделения. Экономичность сокращения числа шагов проиллюстрирована на рисунке 1, который показывает, что общее извлечение быстро уменьшается (от 90 до 60%) с увеличением числа шагов (от 1 до 5; при индивидуальном выходе на каждом этапе 90%). Вообще, желательно варьировать технику разделения (например, IEC + HIC + GF) чтобы удерживать число шагов как можно меньше, например 5.

Комбинация механизмов разделения составляет стратегию разделения, которая диктуется составом МР. Например, IEC может подойти для начальной очистки целевой молекулы из первичного бульона. С помощью AC, которая отличается высоким начальным фактором очистки, можно практически полностью ликвидировать остатки примесей. HIC и RPC могут использоваться для отделения близко родственных молекул, а GF может использоваться для полировочного хроматографического этапа близко родственных растворов отличающихся по размеру молекул (например, отделение мономеров от димеров).

Общее понимание принципов разделения, их особенностей и ограничений поможет в максимизировании эффективности и производительности каждого шага хроматографии и оптимального планирования порядка шагов.

А

Б

Рисунок 2. Хроматографические системы для производственных (А) и научно-исследовательских (Б) целей. Если система для научных исследований разработана максимально гибкой (например, автоматическая буферная подготовка), то система производственная разработана максимально ошибкоустойчивой (различные буфера в этом случае используются для мытья и чистки системы).