ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

1.Промышленная микробиология / З.А. Аркадьева и др. – М.: Высшая школа, 1989. – 380 с.

2.Баснаньян Н.А. Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами. – М.: Наука, 1989. – 267 с.

3.Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. Ч. 2. –

Мир, 1989. – 592 с.

4.Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. – М.:

Агропромиздат, 1990. – 335 с.

5.Попова Т.Е. Развитие биотехнологии в СССР. – М.: Мир, 1987. –

247 с.

6.Реннеберг Р., Реннеберг И. От пекарни до биофабрики. – М.:

Мир, 1991, – 112 с.

7.Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды. – М.: Мир, 1987. – 247 с.

3. МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Отличительные особенности любого биологического объекта обусловлены генетической информацией. В природных условиях случайные процессы мутации осуществляются тремя путями:

–при трансформации организм получает из окружающей среды обрывки ДНК и гены с собственным наследственным материалом;

–при трансдукции новый наследственный материал поступает через вектор в собственный наследственный материал микроорганизма;

–при конъюгации объединяются донор и рецептор.

Эти природные процессы определяют смешивание и поступление чужой наследственной информации в организм. В результате новые информационные единицы не возникают. Происходит лишь проявление имеющегося в наличии наследственного материала. В экспериментальной генетике используются те же методы и достигаются принципиально те же цели, что и в природе.

Новые мутации, возникающие естественным путем, наносят вред существующим штаммам. Гораздо больше изменений можно получить, если геномы двух различных штаммов микроорганизма одного вида пересортировать так, чтобы возникли новые комбинации существующих генов. Молекулы ДНК хромосом разрываются в различных местах и меняются попарно с соответствующими секциями партнерских клеток. Такой процесс может осуществляться в клетках разного вида или в одной клетке.

19

Основной задачей генной технологии является создание новых комбинаций наследственного материала в целых клетках микроорганизмов с последующей передачей введенной информации дочерней клетке.

3.1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Генетическая инженерия – это конструирование функционально активных генетических структур и наследственно измененных организмов. При этом возможно три направления:

–введение генов в клетки бактерий и дрожжей;

–введение генов в клетки растений, животных, человека;

–введение генов в зародышевые клетки.

Появление генно-инженерной методологии стало возможным благодаря предшествующим работам многих исследователей в различных областях биохимии и молекулярной генетики.

Эксперименты генетической инженерии состоят из нескольких последовательных этапов. Первый этап – получение генов, содержащих информацию для синтеза определенной молекулы полипептида.

Молекула ДНК состоит из двух обвивающих друг друга одиночных цепей, в которых закодирован «приказ» по построению белков из аминокислотных остатков. Длина ДНК составляет около 1,4 мм.

Для передачи приказа рибосомам клетка производит множество «отпечатков» приказа ДНК, копий. Например, когда клетка должна срочно построить фермент амилазу для превращения крахмала в сахар, в клубке ДНК «отыскивается» участок с записанным в нем приказом синтезировать амилазу. Длина участка ДНК, содержащего этот приказ, составляет около 0,0001 мм. Участок ДНК, несущий информацию о синтезе определенного белка, и называется геном.

Для снятия копии с гена специальные ферменты постоянно «прокатываются» вдоль цепи ДНК и копируют ее приказы, составляя новую цепь, идентичную «материнской цепи». Затем эта ДНК-копия отъединяется от «материнской» ДНК. Новая цепь имеет длину, равную длине гена, и содержит такой же приказ, что и ген на «материнской» ДНК. В отличие от «материнской», ДНК-копия представляет собой всего лишь одиночную цепь. Эта копия называется информационной РНК.

К копии сразу же присоединяется несколько рибосом, они «нанизываются» по всей длине и «считывают» приказ о сборе молекул аминокислот для построения амилазы. Из рибосом как бы выскальзывают связанные друг с другом аминокислоты. После расшифровки копий рибосомы отторгают выходящие из них длинные аминокислотные цепи, которые сворачиваются в клубки и образуют белки в форме шариков

20

с выемкой на поверхности. Тем временем вдоль ДНК-копии наслаиваются новые рибосомы, и таким образом образуется все больше молекул амилазы. На самом деле все эти процессы значительно сложнее.

Виюле 1980 г. в одной из лондонских больниц 17 добровольцам были сделаны инъекции инсулина. Инсулин обычно получают из поджелудочных желез убойных свиней и крупного рогатого скота. В инсулине свиньи лишь в одном участке цепи содержится аминокислота, иная, чем у человека; а инсулин крупного рогатого скота отличается по трем аминокислотам. Поэтому у некоторых больных диабетом вырабатываются антитела. В подобных случаях помочь может только инсулин человека, который стали получать с помощью кишечной палочки.

Идея заключалась в том, чтобы в ДНК бактерий внести ген человеческого инсулина (подложить «куриное яйцо»). Быть может, рибосомы бактерий обманутся и начнут продуцировать человеческий белок как свой собственный?

Необходимо было средство для транспортирования гена человеческого инсулина в бактериальную клетку. Таким «транспортным средством» послужили плазмиды. Плазмиды – это кольцевые молекулы нехромосомной ДНК с малой молекулярной массой, кодированные для вторичных признаков. Они являются векторной группой в методике генной инженерии.

Оказывается, именно с плазмидами связана приспособительная способность микроорганизмов к антибиотикам. Плазмиды содержат, например, гены пенициллиназ – ферментов, расщепляющих пенициллин. При воздействии пенициллина на клетки их плазмиды передают своим рибосомам приказ о выработке пенициллиназ, которые инактивируют пенициллин. Микробная клетка остается жизнеспособной. Кроме того, при соприкосновении двух бактерий плазмида может перейти из одной бактерии в другую и передать ей приказ к защите против пенициллина.

С. Коэн (1928 г.) предложил использовать «страсть плазмид к путешествиям» для транспортировки генов (рис. 5). Для этого нужно извлечь плазмидное кольцо бактерий, разрезать его, вставить участок чужой ДНК с приказом о выработке белка и ввести обратно в бактерию новое плазмидное кольцо с чужим геном.

В1960-х гг. швейцарский биохимик Вернер Арбер открыл ферменты, «разрезающие» ДНК на участки. Эти ферменты называются рестриктазы. В 1970-х гг. Герберт Бойер в Сан-Франциско установил, что рестриктазы разрезают плазмиды только в определенных местах. Другие исследователи открыли лигазы, которые снова «склеивают» разрезанные участки.

В1973 г. Коэн и Бойер выделили из микробной клетки плазмиды

и«разрезали» их. Затем они выделили ДНК из клеток лягушек, «вырезали» из них с помощью рестриктаз гены. В пробирку со смесью после

21

этого добавили лигазы. Затем снова ввели плазмиды в клетки микроорганизмов – теперь их рибосомы наряду с собственными белками синтезировали и белок лягушки. Таким же методом был получен и человеческий инсулин.

Рис. 5. Схема методики генной инженерии:

1 – участок ДНК клетки-донора;

2 – вырезанный ген;

3 – бактериальная плазмида с встроенной ДНК донора; 4 – введение плазмиды

в бактериальную клетку; 5 – реконструированная клетка;

6 – извлеченная из бактериальной клетки плазмида, «разрезанная» рестриктазой

Наибольшие успехи в области генетической инженерии достигнуты в работах с Escherichia coli, которая стала центральным объектом исследований благодаря генетической изученности. Успешно используют и другие микроорганизмы, такие как Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae и др. Генно-инженерными методами получают некоторые пищевые продукты.

Генная инженерия, прежде всего, является нетрадиционным средством решения ряда проблем. Например, в начале 90-х гг. прошлого века в Австралии возникли колоссальные экологические проблемы в связи с эрозией почвы. К этому привело немыслимое увеличение поголовья овец для производства знаменитой австралийской шерсти. Бесчисленные стада разбивали пастбища, ситуация грозила обернуться экологической катастрофой. Был найден выход: в клевер, основной корм овец, ввели ген подсолнечника. В результате повысилось содержание серы в клевере, а овечья шерсть стала намного гуще. Поголовье овец сократили, а на производстве шерсти это никак не отразилось.

В ст. 26 Федерального закона «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» указано, что условия работы с биологическими веществами, биологическими и микробиологическими организмами и их токсинами, в т. ч. условия работы в области генной инженерии, не должны оказывать вредного воздействия на человека.

22

3.2.КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

3.2.1.Клонирование культур тканей и клеток высших растений

Создание культур растительных клеток стало возможным после того, как были разработаны соответствующие среды и режимы культивирования.

В культуре тканей определенного вида растений в результате деления дифференцированных клеток образуются недифференцированные вакуолизированные клетки, которые растут хаотично и образуют клеточную массу – каллус. Каллус образуется на питательных средах, содержащих минеральные и органические питательные вещества, витамины, сахароспирты, ауксины, а иногда и цитокинины (гормоны роста). После нескольких пересадок каллус может приспосабливаться к росту без фитогормонов, которые начинают синтезировать клетки.

Клетки растений можно культивировать и в жидких питательных средах. Такие культуры называют суспензионными.

Соматические клетки растений являются тотипотентными, т. е. от клеток, изолированных из разных тканей растений, можно регенириро-

и корневой системы. Ауксины стимулируют рост корней, цитокинины – образование конуса роста и побегов. Чтобы образовались и корни, и побеги, ауксины и цитокинины должны быть взяты в определенных соотношениях.

Метод применяют тогда, когда имеются трудности в половом размножении сорта или когда получен удачный гибрид, но его свойства нельзя сохранить, размножая половым путем. Для размножения деревьев используют клетки молодых листьев с верхушки дерева без повреждения верхушечной почки.

Протопласты (содержимое растительной клетки) растений впервые были получены в 1971 г. в лаборатории И. Токебе. Для разрушения клеточной стенки обычно используют ферментные препараты трех видов – целлюлазу, гемицеллюлазу и пектиназу. Чтобы выделить жизнеспособные протопласты, необходим осмотический стабилизатор. В качестве таких стабилизаторов используют сахара (глюкоза, сахароза, сорбит, манит) либо растворы некоторых солей. Кроме осмотических свойств среды должны быть подобраны соответсвующие факторы: рН, освещенность, температура и др.

После прекращения действия ферментов у протопластов начинает образовываться клеточная стенка.

23

Целое растение можно получить от протопластов далеко не всех растений.

Р.Г. Бутенко выделяет факторы, которые определяют способность клеток, возникших из изолированных протопластов, образовывать целые растения:

–видовая специфичность и состояние ткани растений;

–способ и условия выделения протопластов;

–плотность высева протопластов;

–состав питательной среды.

Схему регенерации растения из протопластов можно представить в общем виде:

МАТЕРИНСКОЕ РАСТЕНИЕ

↓

ИЗОЛИРОВАНИЕ ЛИСТА

↓

СТЕРИЛИЗАЦИЯ И РАЗРУШЕНИЕ ЛИСТА

↓

ОБРАБОТКА ПЕКТИНАЗОЙ

↓

УДАЛЕНИЕ ОБОЛОЧЕК ЦЕЛЛЮЛАЗАМИ

↓

ВЫДЕЛЕНИЕ ПРОТОПЛАСТОВ

↓

ТРАНСФОРМИРОВАНИЕ ПРОТОПЛАСТА

↓

РЕГЕНЕРАЦИЯ ОБОЛОЧКИ

↓

ДЕЛЕНИЕ КЛЕТОК

↓

ОБРАЗОВАНИЕ КАЛЛУСА

↓

ИНДУЦИРОВАНИЕ ПОБЕГОВ И КОРНЕЙ ПРИ ПОМОЩИ ГОРМОНОВ

↓

ЦЕЛОЕ ДОЧЕРНЕЕ РАСТЕНИЕ (КЛОН)

Клонирование – наиболее эффективный метод для получения вегетативного потомства растений, обладающего всеми признаками исходной формы. Он позволяет в 3–4 раза ускорить сроки размножения многолетних растений. Микроклональное размножение применяется также для оздоровления посадочного материала. Такая технология дает возможность усовершенствовать и резко ускорить селекционный процесс.

24

Таким образом, из 1 г растительных клеток в пробирке можно вырастить тысячи растений. Подобным образом были размножены земляника, спаржа, ананас, люцерна, картофель, соя. Получаемое потомство называют клоном (от греческого – ветвь). Все они, как однояйцевые близнецы, имеют одинаковый наследственный материал.

Если клетки обработать мутагеном и поместить их в какие-то неблагоприятные условия, выживут только мутанты, устойчивые к этим условиям. Такими неблагоприятными условиями могут быть токсичные вещества (пестициды, гербициды), возбудители болезней или факторы роста, которых не хватает в почве, засоление почвы и т. д.

В результате клеточной селекции получены растения, устойчивые к возбудителям картофельной гнили, фитофторы, к гербицидам и т. д.

Путем клонирования удалось произвести 1000 молодых масличных пальм, которые были высажены в Юго-Восточной Малайзии. Эти пальмы – прямые потомки одной пальмы, оказавшейся необычайно устойчивой против болезней, а также дававшей на 20–30% больше пальмового масла, чем обычно.

При клонировании генетическая информация передается от одного «материнского» организма всем потомкам.

3.2.2 .Соматическая гибридизация клеток растений

Соматическая гибридизация – это слияние лишенных оболочки соматических клеток или их частей. Таким способом можно преодолеть физиологическую несовместимость и скрещивать неродственные виды, получать ассиметричные гибриды.

Слияние протопластов может происходить спонтанно, но более успешно оно осуществляется при использовании индуцирующих факторов. Ими могут быть химические факторы (например полиэтиленгликоль) или физические (переменное электрическое поле).

Соматическую гибридизацию перспективно применять для создания межвидовых гибридов культурных растений с их дикими сородичами. Например, в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН совместно с Институтом картофельного хозяйства Украины получен соматический гибрид дикого и культурного картофеля, устойчивого к Y-вирусу. Работы по соматической гибридизации были успешно проведены также с перцем, томатами и другими пасленовыми, затем с зонтичными и бобовыми. Соматическая гибридизация имеет некоторые преимущества по сравнению с переносом генов, т.к. для этого метода нет необходимости знать молекулярные основы действия генов.

25

3.2.3.Особенности культивирования клеток растений

Вприродных условиях клетки растений находятся в тканях и защищены от механических воздействий внешней среды. Кроме того, эти клетки нуждаются во множестве компонентов минеральной и органической природы для метаболизма и роста.

Для растительных клеток важное значение имеют соли азота, калия, магния, фосфора и ряд микроэлементов. Из органических веществ, помимо углеводов, важны отдельные аминокислоты, витамины и фитогормоны.

Внастоящее время растительные клетки культивируют, как правило, в виде каллуса. Каллусные клетки получают из фрагментов тканей разных органов высших растений, помещая кусочки такой ткани в питательную среду в пробирках, колбах, чашках Петри. В природных условиях каллусная ткань возникает в травмированных местах для анатомической регенерации пострадавшего органа. От инфекции каллусную ткань в природных условиях защищают иммунные механизмы организма. В искусственных условиях необходимо строго соблюдать стерильность. Через 4–6 недель культивирования в питательной среде возникает первичный каллус, который необходимо перенести на свежую питательную среду. При культивировании на агаризованной среде кусо-

чек каллуса, переносимый на свежую среду, должен иметь массу около 60–100 мг. Такие кусочки ткани переносят на 30–40 см3 свежей среды. Каллусная ткань, выросшая на поверхности твердой питательной среды, имеет аморфную структуру, представляющую собой массу тонкостенных клеток. При длительной пересадке каллусные ткани, имеющие первоначальную белую, желтоватую, зеленую или красную пигментацию, могут терять окраску, а структура ткани становится более рыхлой.

Каллусные клетки после ряда делений переходят на обычный для данного растения цикл развития, т. е. начинается их дифференцировка. Этот процесс регулируется гормонами.

Клетки растений можно культивировать и глубинным методом в жидкой среде. Для этого необходимо получить линии клеток, образующих небольшие агрегаты по 5–10 клеток. Для глубинного культивирования более пригодны рыхлые каллусные ткани. Трансплантант желательно обрабатывать пектиназой. Рекомендуется использовать среды, содержащие 2-, 4-дихлорфеноксиуксусную кислоту и не содержащие ионы кальция. В таких средах агрегаты клеток не образуются. Перед пересевом первичную культуру фильтруют через два слоя марли или через нейлоновые либо металлические сита, чтобы отделить крупные агрегаты каллусной ткани и остатки трансплантанта. На образование клеточных агрегатов оказывает также влияние интенсивность перемешивания среды. Глубинное культивирование можно осуществить в кол-

26

бах на качалке при частоте вращения 100–120 об/мин. На 60–100 см3 среды берут 2–3 г свежей каллусной ткани.

Растительные клетки растут и размножаются значительно медленнее, чем клетки микроорганизмов. Время их удвоения составляет 1–3 суток. Процесс культивирования растительных клеток занимает 2–3 недели.

В настоящее время методом культивирования растительных клеток получают вещества вторичного метаболизма (алкалоиды, гликозиды, полисахариды, терпеноиды, полифенолы, эфирные масла, пигменты, антиканцерогены).

3.2.4. Инженерия культур клеток животных и человека

Признание идеи о том, что клетки тканей высших животных можно выделить из организма и затем создать условия для роста и воспроизводства, датируется первым десятилетием 20 в. После того как стало известно, что подобные процессы реальны, наступил второй этап работ, начало которому положила демонстрация возможности выращивания и репродукции в таких клетках вирусов. Третий этап истории начинается со времени, когда была показана практическая возможность получения в клетках животных больших количеств вирусного материала для применения в вакцинных препаратах, и простирается до времени, когда:

–стало возможным вставить в клетки специфические экзогенно полученные гены и получить их экспрессию;

–подтверждена возможность выращивания в культуре из одиночной клетки целой популяции. Когда такие популяции получали из клетки, выделявшей в окружающую среду антитела, то все молекулы антител в надосадочной жидкости были одинаковыми.

Причины и следствия этих двух феноменов в настоящее время интенсивно исследуются, и они знаменуют собой начало четвертого этапа работ в данной области.

Культуры клеток и тканей животных и человека в наши дни широко используют как в научно-исследовательской работе, так и в крупнотоннажных производствах для получения вирусных препаратов, создания материала клеток для трансплантации, синтеза физиологически активных веществ. В последние годы широкое применение получают клонирование, трансплантация эмбрионов и создание гибридом.

Метод клонирования – это метод выведения популяции, все клетки которой получены из одной первичной клетки. Метод позволяет отселекционировать наиболее эффективную субпопуляцию и стабилизировать популяцию клеток с требуемой клеточной функцией. При получении клонов из популяции клеток используют индивидуальные клетки, с тем чтобы образованные ими колонии были дискретными и доступными

27

для физического изолирования их от всех других клеток. Для этого проводят серийные разведения клеточной суспензии до тех пор, пока (теоретически) в единице объема не останется одна клетка. Затем этот объем переносится на чашку для микротитрования. Чашки просматривают под микроскопом, и те из них, в которых обнаруживается только одна клетка, маркируются. Если в этих чашках разовьются колонии, то будет известно, что они произошли из одиночной клетки.

Метод трансплантации эмбрионов представляет большие возможности для увеличения потомства от выдающихся по продуктивности животных, для получения химерных животных и идентичных близнецов. Схему методики трансплантации эмбрионов можно представить в следующем виде:

ГОРМОНАЛЬНОЕ ИНДУЦИРОВАНИЕ СУПЕРОВУЛЯЦИИ

↓

ОПЛОДОТВОРЕНИЕ ЯЙЦЕКЛЕТКИ

↓

ИЗВЛЕЧЕНИЕ ЯЙЦЕКЛЕТКИ ИЛИ ЗИГОТ ИЗ ОРГАНИЗМА ДОНОРА

↓

МАНИПУЛИРОВАНИЕ С ЯЙЦЕКЛЕТКАМИ ИЛИ ЗИГОТАМИ

↓

ИМПЛАНТАЦИЯ ЭМБРИОНОВ В ОРГАНИЗМ РЕЦИПИЕНТА ИЛИ ХРАНЕНИЕ ИХ В ГЛУБОКОЗАМОРОЖЕННОМ СОСТОЯНИИ ДО ИМПЛАНТАЦИИ

С помощью инъекции гормонов можно получить от одного животного десятки яйцеклеток, искусственно их оплодотворить и имплантировать в матку других животных. В животноводстве применяется манипуляция на клетках раннего эмбриона для получения монозиготных близнецов, основанная на том, что индивидуальная клетка раннего эмбриона может развиться в нормальный плод. Клетки эмбриона разделяют на несколько равных частей и трансплантируют реципиентам. Это позволяет осуществить ускоренное размножение продуктивных сельскохозяйственных животных.

Путем трансплантации эмбрионов от одной выдающейся по продуктивности коровы можно получить в год до шести телят, пересаживая эмбрионы в менее продуктивных коров. Трансплантация эмбрионов позволяет сохранить редких диких животных. Так, кобылам были пересажены эмбрионы зебр, и родились зебрята.

Интерес представляет также получение химерных животных. Сущность метода заключается в том, что смешивают клетки эмбрионов ранних стадий двух животных и получают животное, содержащее часть

28

клеток одного животного, часть второго. Гибридизация клеток эмбрионов различных животных позволяет преодолеть межвидовой барьер. Так, в результате смешения клетки зародыша овцы в стадии четырех клеток с восемью клетками зародыша козы и трансплантации их овце были получены овце-козы. Получен также химерный теленок в результате смешивания эмбриональных клеток представителей европейского домашнего и зебувидного скота.

Создание гибридом. Уже в 60-е гг. прошлого века были разработаны методы слияния соматических клеток животных и человека. В этом процессе были использованы вирус Сендай и полиэтиленгликоль, которые существенно увеличивают вероятность образования гибридов.

Переворот в гибридизации клеток совершили работы Г. Келлера и Ц. Мильштейна, которые создали метод получения однородных антител путем слияния опухолевой клетки с клетками селезенки иммунизированного животного. Такие гибриды называют гибридомами. В широком смысле гибридомой являются «бессмертные» гибридные клетки, полученные путем слияния раковых клеток с клетками, продуцирующими ценные вещества. Такую же технику можно применять и для клеток растений. Слияние клеток растений, растущих обычно в культуре медленно, с клетками растительных опухолей позволяет получить клоны быстрорастущих клеток – продуцентов нужных соединений.

Наибольшие успехи достигнуты при создании гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, т. е. антитела, способные реагировать лишь с одним антигеном. Антитела в организме производят В-лимфоциты – недолго живущие клетки, каждая из которых способна синтезировать антитела лишь одной специфичности. Лимфоциты – один из типов белых кровяных клеток – лейкоцитов. В организме одновременно действует множество клонов В-лимфоцитов, поэтому в сыворотке находится смесь антител. Гибридома, в которой объединены опухолевая клетка и В-лимфоцит, синтезирует только антитела одного типа, т. е. моноклональные.

Процесс получения гибридом на основе опухолевых клеток и иммунизированных лимфоцитов состоит из этапов:

–получение опухолевых клеток, погибающих при последующей селекции гибридомных клеток;

–получение лимфоцитов – продуцентов антител к заданным антигенам. Для этого животное иммунизируют введением определенного антигена, потом выделяют клетки селезенки и от них отделяют лимфоциты;

–слияние опухолевых клеток с лимфоцитами. Слияющим агентом служат полиэтиленгликоль, вирус Сендай и лизолецитин, а также электрический импульс;

–селекция гибридомных клеток;

29

–проверка способности гибридомных клеток продуцировать моноклональные антитела к заданному антигену;

–клонирование гибридных клеток, прошедших проверку на образование моноклональных антител, с контролем на стабильность их иммунных свойств;

–получение массовых культур гибридомных клеток. Гибридомные клетки из культуры можно выращивать и в организ-

ме животного – мыши или крысы. Для этого гибридомные клетки вводят животному, опухоли из введенных клеток вырастают через 10–14 суток. Начиная с этого времени у животных берут сыворотку, содержащую высокие концентрации моноклональных антител.

Моноклональные антитела применяют в настоящее время для диагностики инфекционных и онкологических заболеваний и отрабатывают методы их использования для усовершенствования вакцин, изучения патогенеза и иммунологии заболеваний, генетического анализа человека, лечения инфекционных и онкологических заболеваний.

3.2.5. Особенности культивирования клеток животных

Культивирование тканей животных широко применяется в вирусологических исследованиях и при производстве вирусных вакцин. В качестве примера можно рассмотреть получение вакцины Солка из тканевой культуры почек обезьяны. Ткань коркового слоя свежих почек измельчают и суспендируют в питательной среде, затем многократно обрабатывают по 20 мин 0,5%-ным раствором трипсина при рН среды 7,6, чтобы ферментативно гидролизовать ткани и разделить клетки. Суспензию центрифугируют и клетки суспендируют в той же среде с добавлением плазмы телячьей крови или гидролизата лактальбумина. Суспензию клеток инкубируют 5 суток в сосудах, где за это время на стенках сосудов образуется однослойная пленка клеток.

Когда клетки вырастут, жидкую фракцию сливают, клетки промывают изотоническим раствором поваренной соли, добавляют свежую среду и засеивают ее соответствующим вирулентным вирусом полиомиелита. После трехсуточного инкубирования вируса клетки полностью разрушаются, и вирусы переходят в раствор. Остатки клеток удаляют центрифугированием, и оставшийся раствор используют для вакцинации. Для сохранения вакцину замораживают.

При помощи натуральных животных клеток получают также β-интерферон и урокиназу.

В последнее время культуры клеток животных стали использовать также для получения биологически активных белков.

30

С помощью трансформированных методом генетической инженерии клеток животных сегодня получают человеческий γ-интерферон, поверхностный антиген гепатита В, иммуноглобулин и другие вещества. При этом нетрансформированные клетки животных продуцируют необходимый белок значительно медленнее, чем трансформированные клетки, к тому же концентрация вещества у трансформированных в 50 раз выше.

Животные клетки уступают бактериальным по продуктивности

идостигаемой концентрации продукта в среде. Вместе с тем, несмотря на явные преимущества бактериальной культуры на стадии ферментации, выделение целевого белка из ее биомассы намного сложнее, чем из среды с животными клетками. Потери биологической активности в случае выделения нужного белка из биомассы бактерий в 1000 раз превышает потери при выделении этого белка из среды с животными клетками.

Для культивирования животных клеток используют те же технические средства, которые применяют для культивирования микроорганизмов. Однако в этих случаях необходимо добиваться того, чтобы в биореакторах не происходили механические повреждения животных клеток, которые менее прочны, чем клетки микроорганизмов. Внутренняя поверхность биореакторов должна быть гладкой, а механические мешалки не должны создавать сильную турбулентность среды. Большинство клеток требует поверхности для своего роста.

Чтобы повысить концентрацию клеток в биореакторе, практикуют отделение клеток от среды при помощи мембран. Необходимо учитывать, что размеры животных клеток составляют примерно 5–10 мкм.

Практикуется также адсорбция клеток к поверхности полых волокон или флокуляция при помощи специальных флокулянтов в матриксы. Наиболее широко применяются для культивирования животных клеток шарообразные матриксы из стекла, синтетических полимеров. При этом основная задача состоит в том, чтобы стабилизировать клетки

исоздать для них оптимальные условия. В матриксах клетки могут быть иммобилизованы не только адсорбцией, но и ковалентным и перекрестным связыванием. Для этого можно использовать такие материалы, как желатин, полилизин, альгинат и агарозу. Выбор конкретного материала зависит также от предназначения иммобилизованных клеток. Такая техника нашла применение для защиты клеток при перевозке или пересылке клеток из одной лаборатории в другую, обеспечении длительного хранения их при температуре 4ºС, исключении иммунного отторжения трансплантированных клеток и защиты хрупких клеток (гибридом) от механических воздействий в биореакторах.

Матриксы обеспечивают свободный диффузионный обмен между замкнутым микроокружением клетки и средой, питательными веществами и образующимися продуктами. Чтобы защитить клетки от травм и

31

колебаний температур при перевозках, достаточно добавить клетки в питательную смесь с желатином при температуре 37ºС. При переносе такой смеси в окружающую среду температурой 4ºС происходит быстрое загустение. Клетки можно освободить от загустевшего матрикса путем нагревания материала до 37ºС и разбавления его свежей средой. Такая техника дает, например, возможность рассылать диплоидные клетки человека и первичные клетки обезьян из лаборатории Р.Е. Спиера (Англия) по всему миру.

При культивировании иммобилизованных клеток значительно легче производить смену среды в биореакторе, регулировать соотношение объемов клеток и питательной среды, выделять продукты, свободные от клеток.

3.2.6.Получение медицинских препаратов и лекарственных веществ

спомощью микроорганизмов и культур тканей

Гормоны. Свойствами гормонов могут обладать небольшие молекулы пептидов и молекулы белков. В зависимости от величины и структуры молекул гормоны делят на три группы.

Первая группа – пептидные гормоны. К этой группе относятся факторы гипоталамуса, гормоны гипофиза, щитовидной железы, пищеварительного тракта и поджелудочной железы. В железах внутренней секреции гормоны образуются из длинных молекул предшественников под воздействием расщепляющих ферментов.

Вторая группа – гормоны роста и пролактины. Гены гормонов роста синтезируются в клетках по информации мРНК либо искусственно.

Третья группа – гликозилированные гормоны. Для получения таких гормонов их гены вводят в клетки дрожжей или в клетки культур тканей.

Инсулин – первый препарат, производимый бактериями, в которые был введен ген инсулина человека. Первые сообщения о получении инсулина из бактериальных клеток поступили в 1982 г. из нескольких лабораторий. Для лечения сахарного диабета до сих пор используют инсулин, полученный из поджелудочной железы коров и свиней. Эти виды инсулина несколько отличаются по аминокислотному составу от человеческого инсулина, они устраняют главные проявления диабета, но не устраняют побочные осложнения – повреждение почек и глазной сетчатки. Кроме того, инсулин вызывает иммунную реакцию при инъекции.

В настоящее время инсулин получают из культур Bacillus subtilis и Saccharomyces cerevisiae с помощью методов генетической инженерии.

Ферменты. В медицине ферменты используют для замены нефункционирующего фермента или увеличения количества фермента, которо-

32

го недостаточно в организме. В медицине применяют несколько ферментов, полученных методами генетической инженерии. Например, в клиниках США прошла проверку человеческая супероксиддисмутаза, продуцированная микроорганизмами. С помощью этого фермента лечат ишемическую болезнь сердца, интоксикацию кислородом, артриты, его также используют при пересадке почек.

Для разрушения тромбов в медицине используют урокиназу и стрептокиназу. Урокиназу синтезируют клетки стенок мочевода, ее можно выделить из мочи. Стрептокиназу синтезируют бактерии. Медицинскую урокиназу можно получить методами генетической инженерии.

В Японии с 1984 г. урокиназу производят из культур тканей. Интерфероны – белки, которые синтезируются в разных клетках

организма. Их главная функция – защита организма от вирусных инфекций. Кроме того, интерфероны тормозят деление клеток, в т. ч. опухолевых, влияют на иммунные реакции организма, защищают клетки от радиационного повреждения. По своему действию интерфероны напоминают гормоны. Это вещества с очень высокой активностью. Впервые интерферон был описан в 1956 г. английскими учеными А. Исааком и Е. Линдеманом.

Интерфероны имеют видовую специфичность. В связи с этим интенсивно разрабатывались методы получения человеческого интерферона из клеток культур отдельных тканей человека, а также из микроорганизмов методами генетической инженерии.

В клетке интерферон начинает синтезироваться в ответ на определенные возбудители. Основным возбудителем синтеза интерферона являются вирусы.

Исторически первым методом получения интерферона можно считать метод П. Кантеллы, основанный на культивировании лейкоцитов и очистке интерферона. Лейкоциты помещают в поддерживающую среду. Синтез интерферона проводят 16–20 ч при помощи вируса Сендай. Проведение синтеза интерферона надо начинать не позднее 24 ч после взятия крови. Возможности метода Кантеллы ограничены, так как для получения интерферона требуется много донорской крови.

Интерферон также получают от культур диплоидных клеток. Синтез интерферона проводят при помощи синтетической РНК.

ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЯ

1.Охарактеризуйте метод генной инженерии.

2.Что такое плазмиды? Какова их роль в генной инженерии?

3.Для каких целей в генной инженерии применяются ферменты рестриктазы? Лигазы?

33