2.3. ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Микроорганизмы способны ассимилировать любое органическое соединение, поэтому потенциальными ресурсами для микробиологической биотехнологии могут служить все мировые запасы органических веществ, включая первичные и вторичные продукты фотосинтеза.

Но каждый конкретный вид микроорганизмов, используемый в биотехнологии, весьма избирателен к питательным веществам, и органическое сырье (кроме лактозы, сахарозы и крахмала) без предварительной химической обработки малопригодно для микробного синтеза. Потребность в тех или иных веществах определяется физиологическими особенностями данного вида микроорганизмов, но во всех случаях среда должна представлять собой водный раствор этих веществ и обеспечивать приток их в клетку в определенном количестве.

Ориентировочный состав питательной среды можно определить на основе состава клеточного вещества микроорганизмов. В табл. 2 приведен усредненный элементарный состав биомассы некоторых микроорганизмов:

Кроме приведенных в табл. 2 элементов и соединений в состав клеток всегда входят микроэлементы: В, Мо, Mn, Zn, Cu, Br, J, Co, необходимые микроорганизмам для образования ферментов и витаминов. Обычно микроэлементы вносят в среду вместе с водопроводной водой.

Микроорганизмы используют питательные вещества среды не только на построение клеточного вещества, но и на обеспечение энергией всех биохимических превращений в клетке.

11

В процессе роста культуры состав среды меняется, это оказывает влияние на развитие культуры и ее биосинтетическую способность.

Часто сырьем для выращивания микроорганизмов служит материал, который они не в состоянии использовать без предварительной подготовки (целлюлоза, гемицеллюлоза, крахмал, пектин и т. д.). В этих случаях для приготовления питательной среды биополимеры предварительно гидролизуют ферментативным или химическим способом до получения усвояемой формы.

Наибольшее значение среди веществ питательной среды имеет углерод. Он входит в состав почти всех органических соединений клетки: аминокислот, белков, углеводов, нуклеиновых кислот, липидов.

Большинство микроорганизмов, применяемых как продуценты белков и аминокислот, в качестве источника углерода используют органические вещества. Клетки сине-зеленых водорослей используют диоксид углерода. Непосредственным источником углерода могут быть углеводы несложного строения: гексозы, пентозы, низкомолекулярные олигосахариды, органические кислоты, спирты, жирные кислоты, легкие и тяжелые углеводороды и др.

Азот микроорганизмы усваивают только в виде неорганических солей, кислот, органических соединений. Незначительный недостаток азота в питательной среде приводит к «ожирению» клеток, т. е. к повышению содержания в них липидов за счет уменьшения белковой и аминокислотной фракции. Поэтому в производственных условиях при получении обогащенных белком кормовых дрожжей следят за тем, чтобы в среде не было недостатка азота.

Источниками фосфора являются соли фосфорной кислоты. Их вносят в среду с различными естественными субстратами (отварами растительных тканей, мукой, кукурузным экстрактом), реже – с синтезированными соединениями (фитин). В клетке фосфор входит в состав АТФ, АДФ, АМФ, обеспечивая энергетический и конструктивный обмен.

Состав питательной среды для каждого продуцента устанавливают экспериментально. Это трудоемко и требует глубоких знаний физиологии микроорганизма.

Для обеззараживания питательных сред применяют дезинфекциию, воздействие температуры и других физических факторов (ультразвук, ультрафиолетовое облучение, ультрафильтрация). Каждый из этих методов весьма избирателен. В биотехнологии широко применяют термические методы обеззараживания (автоклавирование, стерилизацию, кипячение, пастеризацию и др.).

Состав среды и оптимальные режимы определяют двумя способами: длинным многостадийным эмпирическим подбором и использованием математических методов планирования эксперимента. Первый способ является самым распространенным в настоящее время.

12

2.4. МЕТОДИКА КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Высокопродуктивные штаммы микроорганизмов по большей части так чувствительны и так «избалованы» биотехнологами, что они просто не в состоянии выжить в нормальных условиях. Например, плесневому грибу-суперпроизводителю его необыкновенная способность производить в 1000 раз больше пенициллина по сравнению с его диким предком не приносит никакой пользы, это не его решение в борьбе за жизнь. Он принуждается к «сверхпроизводительности» человеком, который изменяет его наследственную природу и условия существования. Поэтому только в искусственно созданных условиях, при «комфортных» температурах, с избытком предпочитаемого питания, оберегаемые от природных конкурентов и врагов, такие микроорганизмы способны существовать и служить производителями.

Путем тщательной селекционной работы получают высокопродуктивные штаммы микроорганизмов для производства определенного вещества, например пенициллина, подбирают также оптимальную питательную среду.

Селекционируя любой живой организм, опираются на естественные движущие силы эволюции – наследственные изменения и отбор положительных экземпляров. Однако микроорганизмы как объект селекции имеют ряд особенностей:

–выращивание микробной культуры из одной клетки приводит

кобразованию клона, имеющего генетическую однообразность, но клон микроорганизмов быстро достигает такой численности, что за счет естественных мутаций превращается в популяцию – совокупность клеток с разными генотипами;

–большинство микроорганизмов имеют один экземпляр хромосом, поэтому у них нет изменчивости, являющейся основой селекции высших организмов;

–селекцию клеток можно вести только вегетативным путем, так как они не способны к половому размножению;

–возможностей для отбора положительных экземпляров при селекционировании микроорганизмов больше, так как микроорганизмы отличаются исключительно быстрой сменой поколений.

По определению Л.И. Воробьевой (1987 г.), промышленный штамм должен соответствовать следующим требованиям:

–расти на дешевых и доступных субстратах;

–обладать высокой скоростью роста биомассы и давать высокую продуктивность целевого продукта при экономичном потреблении питательного субстрата;

–проявлять направленную биосинтетическую активность при минимальном образовании побочных продуктов;

13

–быть устойчивым к фагам и другой посторонней микрофлоре;

–быть безвредным для людей и для окружающей среды;

– целевой продукт биосинтеза должен иметь экономическую и народнохозяйственную ценность и легко выделяться из сброженного субстрата.

Процесс выращивания микроорганизмов проводят в две стадии:

–получение чистой культуры посевного материала;

–выращивание микробных масс в промышленных биореакторах. Посевной материал – чистая культура микроорганизмов, которая

получается путем ее последовательного асептического пересева из пробирки в колбу, а затем в аппараты увеличивающегося объема.

Приготовление посевного материала производится по следующим ступеням выращивания:

–в условиях лаборатории;

–в малом посевном аппарате;

–в большом посевном аппарате;

–в малом ферментаторе (биореакторе);

–в промышленном ферментаторе (биореакторе).

2.4.1. Подготовка посевного материала в лабораторных условиях

В условиях лаборатории главной задачей является необходимость сохранить исходный штамм в неизменном состоянии. Споры микроорганизмов – наилучшая форма сохранения их исходного штамма. Однако при длительном хранении культуры могут возникнуть спонтанные нерегулируемые мутации. Наиболее распространенный способ поддержания жизнедеятельности культур – периодические пересевы продуцента на свежие питательные среды. Необходимо не только периодически проводить рассев культуры, но и осуществлять проверку ее однородности как по морфологическим, так и по физиологическим признакам. При рассеве из колонии, давшей наилучшие показатели на диагностирующей среде, делают новый рассев в 30–40 пробирок. Затем из каждых 5–6 пробирок отбирают одну и проверяют находящиеся в ней микроорганизмы на способность образовывать то вещество, продуцентом которого они являются. Проведение такой непрерывной селекции позволяет сохранить в активной форме исходящую культуру продуцента.

Однородный штамм микроорганизмов высевают в пробирки, выращивают до определенного возраста в оптимальных условиях, а затем перемещают в холодильник при температуре 3–4ºС. Пересевы культур производят через определенные промежутки времени. Длительные паузы между пересевами недопустимы, так как при этом истощается и сохнет среда, сказываетсяотрицательноевлияниеметаболитов, возможнымутации.

14

Однако при многократных пересевах увеличивается возможность потери активности продуцента, поэтому любой продуцент лучше хранить в консервированном виде.

Для длительного хранения ряда штаммов часто используют крахмальные среды. Более длительное время можно хранить культуру под слоем стерильного, химически чистого вазелинового масла. Хранят культуры при температуре –14 … –11ºС с пересевами через 10–16 месяцев.

Грибные и дрожжеподобные культуры хранят в 10%-ном растворе глицерина в запаянных ампулах в атмосфере жидкого азота при температурах –196 … –165ºС. Эти культуры даже через 5 лет сохраняют свои физиолого-биохимические свойства.

В настоящее время самый распространенный способ сохранения микробных культур – лиофилизация. Она заключается в том, что вода при пониженном атмосферном давлении испаряется из замороженного материала, превращаясь в пар, минуя жидкое состояние. В целях увеличения выживаемости вегетативных клеток микробов перед лиофилизацией их, как правило, помещают в защитные среды (стерильную бычью сыворотку, лошадиную сыворотку, смесь 10%-ного раствора сахарозы и 1%-ного раствора желатина). Защитные среды, очевидно, регулируют осмотическое давление клетки при высушивании. Микроорганизмы помещают в стерильные ампулы, закрывают стерильными ватными тампонами и быстро замораживают при температуре –78 … –35ºС, затем высушивают в вакуум-сушильном аппарате при температуре 20 – 22ºС и остаточном давлении 10 Па в течение 25–30 ч, после чего ампулы запаивают и хранят до 5–6 лет.

Штаммы можно хранить в стерильной почве. Часто хранят штаммы на распаренном зерне (пшене). В этом случае 100 г пшена кипятят в течение 30 мин с 80 см3 воды, высыпают на чистый стол и разбивают комки. Остывшие зерна по 15–16 г засыпают в стерильные флаконы вместимостью 250 см3, закрывают ватной пробкой и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 40 мин. На стерильное распаренное пшено наносят 2 см3 густой взвеси спор или 3 см3 вегетативной биомассы продуцента. Микроорганизмы выращивают при периодическом встряхивании при температуре 25–30ºС. Готовую культуру высушивают в вакууме при температуре 25ºС в течение 60–70 ч.

Заготовленные чистые культуры микроорганизмов по мере необходимости подают в промышленное производство.

Методика реактивации существенно отражается на выживаемости клеток и должна разрабатываться для каждой культуры отдельно.

Часто при переходе от лабораторных условий к культивированию в промышленных масштабах происходит утрата свойств продуцентов.

Получение чистой культуры можно осуществлять в лабораторном ферментаторе периодического или непрерывного действия (рис. 3).

15

данного продукта. Например, если надо получить большие количества дрожжей, используемых как кормовая добавка, то строят гигантские биореакторы размерами с многоэтажный дом и вместимостью до 1500 м3; цилиндрические резервуары для производства дрожжей из нефти достигают примерно 40 м в высоту и 20 м в ширину. В пенициллиновом производстве биореакторы имеют меньшие размеры, их вместимость не более 100 м3. Для научно-исследовательской работы в лабораториях испытывают мини-реакторы вместимостью несколько литров.

Для хорошего «самочувствия» микроорганизмов важное значение имеет температура питательного раствора. Для большинства микроорганизмов оптимальная температура составляет 20–50ºС. Таким образом, наиболее высокая продуктивность попадает в диапазон от нормальной до «тропических» температур.

В химической промышленности, наоборот, при производстве различных веществ требуются очень высокие температуры, в сотни градусов Цельсия. Для достижения таких температур приходится сжигать гигантские количества топлива (угля, нефти, газа). Это дорого. Чаще всего для биотехнологических процессов требуется даже охлаждение, так как плесени и многие микроорганизмы при потреблении питательных веществ выделяют тепло. Поэтому во избежание смертельного для микроорганизмов перегрева стенки биореакторов охлаждают водой.

Для ускорения превращения веществ в химических производствах нередко требуются высокие давления. Микроорганизмы действуют при нормальном давлении.

Рост культуры можно охарактеризовать временем удвоения количества клеток или биомассы. Однако эти величины могут различаться, так как биомасса может увеличиваться и без деления клеток. Рост числа клеток, биомассы сопровождается изменением содержания биополимеров в биомассе, в частности ДНК, РНК. Если в данных условиях культивирования время удвоения биомассы и числа клеток не различается, значит, рост культуры происходит согласно экспоненциальной зависимости:

dx / dt = µx, или dN / dt = µN,

где N – количество клеток в 1 дм3 среды; x – концентрация биомассы, г/дм3; µ – удельная скорость роста, 1/ч.

Посевной материал, попав в свежую полноценную среду, начинает размножаться не сразу. Только после определенного времени, иногда через несколько часов, клетки приспосабливаются к окружающей среде.

17