Хроматография

Хроматография представляет собой физико-химический метод разделения

смесей веществ, основанный на многократно повто-ряющихся процессах сорбции и десорбции. Этот метод разработал М.С.Цвет. Через стеклянную трубку, наполненной порошкообразным оксидом кальция, он пропустил экстракт зеленых листьев в хлороформе. Вещества экстракта разделились и заняли на столбике адсорбента различные участки по высоте в виде окрашенных зон разного цвета. В связи с этим, Цвет назвал этот метод хроматогра-фией. Обязательным условием для проведения хрома-тографии является наличие подвижной и неподвиж-ных фаз. Вдоль частиц или слоя неподвижного ве-щества (адсорбента) медленно движется раствор или газ, содержащие смесь разделяемых веществ. Молекулы или ионы каждого вещества многократно адсорбируются и десорбируются с адсорбента. Поскольку сила связывания каждого вещества с адсорбентом различна, они переносятся вдоль него

21

подвижной фазой с разной скоростью, что приводит к их разделению. Вещества, не способные к адсорбции, будут при хроматографии находиться только в подвижной фазе, скорость их перемещения вдоль адсорбента будет максимальной. Хорошо адсорбируемые вещества, наоборот, будут передви-гаться медленно. После хроматографии разные вещества смеси оказываются в разных порциях раствора (или газа), прошедших через адсорбент. По необхо-димости их отделяют и анализируют.

По механизму адсорбционного связывания разделяемых веществ с адсор-бентом различают адсорбционную, ионообменную, хемосорбционную, распределительную и молекулярно-ситовую (гель-фильтрацию) хрома-тографию.

По агрегатному состоянию подвижной фазы различают жидкостную и газовую хроматографию.

По техническому исполнению различают колоночную и плоскослойную (бумажную и тонкослойную) хроматографию.

Молекулярно-ситовая хроматография (гель-фильтрация) представляет раз-деление веществ по размеру их молекул в колонках, заполненных гелем. Ад-сорбенты представляют молекулярные сита. По структуре они подобны ге-лям, имеют пустые ячейки и пронизаны порами. При прохождении через слой геля, небольшие молекулы разделяемых веществ свободно диффундируют в поры гранул и их выход замедляется лабиринтом пор. Более крупные молеку-лы не проходят в поры и они быстрее переносятся раствором, протекающим между гранулами. Таким образом, с адсорбента вещества вымываются по отдельности: вначале с большой молекулярной массой, а затем – с малой. Чем значительнее молекулы отличаются по размерам, тем больше вероятность их разделения.

Ионообменная хроматография основана на применении сорбентов, спо-собных обменивать собственные ионы, образующиеся при диссоциации их молекул, на ионы из раствора. В качестве адсорбента используют ионообмен-ные смолы, структурным каркасом которых служат синтетические полимеры, связанные с различными функциональными группами. В катионитах функ-циональные группы при диссоциации отщепляют катионы, а аниониты – анионы.

В связи с тем, что диссоциация функциональных групп и адсорбционная способность ионообменника, сродство разделяемых (амфотерных) веществ к адсорбенту зависят от кислотности среды, разделение (элюцию) проводят с применением буферных растворов. При этом адсорбцию проводят в одном буферном растворе, а элюцию – в другом. Так, диссоциация карбоксильных групп аминокислот глицина и аспарагина в буферном растворе с рН 2,2 по-давлена, аминокислоты заряжены положительно за счет присоединения ионов водорода к аминогруппам: HOOC-CH₂-NH₃⁺, H₂N-CO-CH₂-CH(COOH)-NH₃⁺. Поэтому аминокислоты будут вытеснять ионы натрия из сульфогрупп смол и связываться с ними:

R-SO₃Na + HOOC-CH₂-NH₃⁺ → R-SO₃Na + HOOC-CH₂-NH₃⁺SO₃R + Na⁺.

При элюировании буферным раствором с рН 4,1, карбоксильные группы ами-нокислот могут диссоциировать, а аминокислоты иметь как положительный, так и отрицательный заряд. Поэтому аминокислоты слабее удерживаются со смолой и вымываются из колонки. Причем, ввиду разного внутримолекуляр-ного окружения, карбоксильная группа аспарагина диссоциируется в большей степени и поэтому она элюируется раньше, чем глицин.

Рис. 10.Колонка для ионообменной хроматографии

Рис. 11. Хроматограмма. Ионообменную хроматографию обычно проводят в колонках, наполненных суспензией ионообменника. На открытую поверхность ионообменника наносят раствор разделяемых веществ и дают ему впитаться. Затем через колонку пропускают буферный раствор. Раствор, выте-кающий из колонки (элюат) собирают порциями и опреде-ляют содержание веществ. Результаты обычно выражают в виде зависимости концентрации веществ от объема элюата, на которой проявляются максимумы для каждого вещества.

Ионообменная хроматография используется для:

- разделения близких по свойствам элементов с применением комплексо-образующих реагентов;

- удаления мешающих элементов;

- концентрирования ценных микроэлементов из природных и промышленных вод;

- количественного определения суммарного содержания солей в растворах;

- деминерализации воды;

- получения кислот, оснований, солей, извлечения редких и рассеянных элементов (уран, золото, серебро, германий и др.).

Хроматография широко используется в химических исследованиях для изучения смесей органических соединений, продуктов нефтепереработки, инсектицидов и др. В биотехнологии хроматография используется для очи-щения лекарственных средств (например, ферментов, гормонов). В медико-биологических исследованиях хроматографию применяют для разделения и анализа клеток, субклеточных фракций, нуклеиновых кислот, белков, ами-нокислот, липидов, гормонов и других веществ биологического происхож-дения. С помощью хроматографии в биологических жидкостях можно опре-делять различные микрокомпоненты (алкоголь, алкалоиды, наркотические и летучие вещества), которые появляются при наличии патологии.