Общая микробиология
.pdf6.3. Микроорганизмы и процессы, применяемые в биотехнологии На Земле существует около 100 000 видов бактерий, не считая
многочисленных грибов (250 тыс. видов), вирусов, простейших. Микробы, как указывалось, способны синтезировать продукты или осуществлять реакции, полезные для биотехнологии. Однако в практике используют не более 100 видов микроорганизмов, так как остальные мало изучены.
Так, например, дрожжи используют в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательных сред для выращивания бактерий и культур животных клеток.
Из бактерий в биотехнологии чаще всего используются: род Acetobacter — для превращения этанола в уксусную кислоту, в углекислый газ и воду; род Bacillus — для получения ферментов (В. subtilis), средств защиты растений (В. thuringiensis); род Clostridium — для сбраживания Сахаров в ацетон, этанол, бутанол; молочнокислые бактерии (Lactobacillus и др.); псевдомонады, например Ps. denitrificans, — для получения витамина В12; Corinebacterium gentamicum — для получения аминокислот, и др.
Из грибов в биотехнологии для получения разнообразных антибиотиков применяют род Streptomices, Peniciliumchrysogenium, Cefalosporum acremonium, Streptomyces spp. и др.
Естественно, широкое применение в получении диагностикумов, вакцин, иммуноглобулинов, эубиотиков, фагов и других микробных препаратов находят патогенные и вакцинные штаммы болезнетворных микробов, а также условно-патогенные микроорганизмы.
Многие микроорганизмы — бактерии, дрожжи, вирусы — используются в качестве реципиентов чужеродного генетического материала с целью получения рекомбинантных штаммов — продуцентов биотехнологической продукции. Так, получены рекомбинантные штаммы Е. coli, продуцирующие интерфероны, инсулин, гормоны роста, разнообразные антигены; штаммы В. subtilis, вырабатывающие интерферон; дрожжи, продуцирующие интерлейкины, антигены вируса гепатита В, рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антигены гепатита В, вирус клещевого энцефалита — ВИЧ и другие антигены.
Широкое применение в биотехнологии нашли культуры животных и растительных клеток. Известно, что строение, физиология и биохимия животных и растительных клеток более сложны, чем бактериальных клеток. Хотя из животных и растительных клеток можно извлекать более широкой ассортимент сложных и ценных веществ, однако их трудно культивировать. Из культур клеток растений (так же как и из растений) можно получать разнообразные соединения, используемые в медицине (алкалоиды, противовоспалительные вещества, противолейкозные и противоопухолевые, противобактериальные, сердечные и мочегонные средства, ферменты, опиаты, витамины и др.), в сельском хозяйстве, в химической и других отраслях промышленности. Например, разработано и освоено в крупномасштабном производстве выращивание клеток женьшеня, обладающего биологическим действием, присущим природному
женьшеню.
Животные клетки используют как для получения продукции, синтезируемой клетками, так и для выращивания в клетках вирусов с целью получения из них вакцин и диагностических препаратов. Для этого используют перевиваемые и первичные (первично-трипсинизированные) клетки человека и животных, полученные из различных нормальных органов (легких, кожи, почки, костного мозга, соединительной ткани) или опухолевых тканей. Штаммы животных и растительных клеток поддерживаются в специальных сложных условиях (замороженные в жидком азоте) и как можно реже подвергаются пересевам, так как они могут претерпевать генетические изменения.
Технология получения продуктов микробного и клеточного синтеза принципиально сводится к нескольким типовым стадиям: выбор продуктивного штамма; подбор оптимальной для роста экономичной питательной среды; культивирование; выделение целевого продукта, его стандартизация и придание лекарственной формы препарату. Перечисленные стадии и процессы осуществляются в промышленной биотехнологии на соответствующем оборудовании и аппаратуре в крупных масштабах при получении многих медицинских препаратов.
6.4. Генетическая инженерия и область ее применения в биотехнологии Генетическая инженерия является сердцевиной биотехнологии. Она, по
существу, сводится к генетической рекомбинации, т. е. к обмену генами между двумя хромосами, которая приводит к возникновению клеток или организмов с двумя и более наследственными детерминантами (генами), по которым родители различались между собой. Метод рекомбинации in vitro или генетической инженерии заключаются: а) в выделении или синтезе ДНК из отличающихся друг от друга организмов или клеток; б) получении гибридных молекул ДНК; в) введении рекомбинатных (гибридных) молекул в живые клетки; г) создании условий для экспрессии и секреции продуктов, кодируемых генами.
Гены, кодирующие те или иные структуры, или выделяют (клонируют) как таковые (хромосомы, плазмиды), или прицельно выщепляют из этих генетических образований с помощью ферментов рестрикции. Набор этих ферментов, а их уже известно более тысячи, способны резать ДНК по многим определенным связям, что является важным инструментом генной инженерии.
В последнее время обнаружены ферменты, расщепляющие по определенным связям РНК, наподобие рестриктаз ДНК. Эти ферменты названы рибозимами.
Чтобы представить генетические структуры клеток человека, бактерий, а также вирусов, приведем такие данные. Бактериальная хромосома представляет собой молекулу ДНК длиной 1 мм, состоящую приблизительно из 3 млн. пар нуклеотидов. В клетке она компактно уложена несколько тысяч раз и занимает пространство менее 1 мкм в поперечнике. В клетках человека ДНК организована в 46 хромосом, каждая из которых
содержит молекулу ДНК длиной 4 см, а полное число нуклеотидов в ней приближается к 3 млрд. пар.
Сравнительно небольшие гены могут быть получены с помощью химического синтеза. Для этого вначале расшифровывают число и последовательность аминокислот в белковой молекуле вещества, а затем по этим данным узнают очередность нуклеотидов в гене, поскольку каждой аминокислоте соответствуют три нуклеотида (кодон). С помощью синтезатора создают химическим путем ген, аналогичный природному гену.
Полученный одним из способов целевой ген с помощью ферментов лигаз сшивают с другим геном, который используется в качестве вектора, для встраивания гибридного гена в клетку. Вектором могут служить плазмиды, бактериофаги, вирусы человека, животных и растений. Для РНК-вирусов передача генетической информации возможна с помощью ревертазы (обратной транскриптазы), которая передает информацию о структуре белка от РНК к ДНК, которая является комплементарной информационной РНК.
Экспрессируемый ген в виде рекомбинатной ДНК (плазмида, фаг, вирусная ДНК) встраивается в бактериальную или животную клетку, которая приобретает новое свойство — продуцировать несвойственное этой клетке вещество, кодируемое экспрессируемым геном.
В качестве реципиентов экспрессируемого гена чаще всего используют Е. coli, В. subtilis, псевдомонады, дрожжи, вирусы. Реципиента подбирают не только с учетом возможности встройки чужеродного гена, но и уровня выраженности (экспрессии) синтеза вещества, кодируемого геном, возможности его секреции в окружающую среду, легкости и доступности массового культивирования, экологической безопасности. Некоторые штаммы рекомбинантных бактерий способны переключать на синтез чужеродного вещества, экспрессируемого геном, до 50 % своей синтетической возможности. Такие штаммы — суперпродуценты целевых продуктов уже получены и применяются в биотехнологической промышленности. В качестве примера можно привести штаммы — суперпродуценты триптофана, интерферона и других веществ.
Некоторые штаммы микроорганизмов хорошо экспрессируют чужеродные гены, но плохо секретируют продукт в окружающую среду. В таких случаях приходится прибегать к дезинтеграции (разрушению) клетки с целью высвобождения из нее синтезированного продукта. Иногда, несмотря на наличие экспрессии и секреции продукта клеткой, его не удается получить, вернее — собрать, из-за разрушения в процессе синтеза или после него протеазами и другими ингибиторами. В некоторых случаях с целью повышения уровня секреции целевого белка к гену целевого белка присоединиют ген-индикатор, т. е. ген, кодирующий легко узнаваемый белок, в результате этой манипуляции получают химерный белок, а из него
— целевой белок. В качестве индикатора может быть, например, β-галактозидаза, можно использовать ген интерферона и т. д.
Методом генетической инженерии созданы сотни препаратов
медицинского и ветеринарного назначения, получены рекомбинантные штаммы-суперпродуценты, многие из которых нашли практическое применение. Уже применяются в медицине полученные методом генетической инженерии вакцины против гепатита В, интерлейкины-1, -2, -3, -6 и другие, инсулин, гормоны роста, интерфероны α, β, γ, фактор некроза опухолей, пептиды тимуса, миелопептиды, тканевой активатор плазминогена, эритропоэтин, антигены ВИЧ, фактор свертываемости крови, моноклональные антитела и многие антигены для диагностических целей.
Разработаны и в ближайшие годы будут использованы в практике генно-инженерные вакцины против малярии, ВИЧ-инфекции, сифилиса, клещевого энцефалита, холеры, бруцеллеза, гриппа, бешенства и других инфекций; интерлейкины-6-18, пептиды тимуса, колониестимулирующие факторы, эпидермальный фактор роста, атриальный пептид, фактор тромбоцитов, рекомбинантные антигены многих бактерий и вирусов, нейропептиды и другие поведенческие пептиды, рецепторы клеток, ферменты, метаболиты, тканевые антигены, антигены опухолей и др.
Работы по созданию рекомбинантных препаратов ведутся широким фронтом. Быстрому внедрению их в практику препятствуют следующие преодолимые обстоятельства.
Во-первых, длительное время к генно-инженерным препаратам и рекомбинантным штаммам микроорганизмов относились настороженно и даже с опаской, боясь, что может произойти неуправляемое распространение экологически опасных рекомбинантных микробов, а в препаратах может содержаться нежелательная для организма генетическая информация. Однако в настоящее время эти опасения практически сняты, так как доказана безопасность при соблюдении определенных правил и самих рекомбинантных штаммов, и препаратов, полученных на их основе.
Во-вторых, использование рекомбинантных штаммов-продуцентов предусматривает разработку сложных технологических процессов по получению и выделению целевых продуктов. На разработку технологии обычно затрачивается значительно больше средств, чем на получение штамма.
В-третьих, при получении препаратов генно-инженерным способом всегда возникает вопрос об идентичности активного начала, вырабатываемого рекомбинантным штаммом-продуцентом, природному веществу, т. е. требуется проведение исследовательских работ, направленных на доказательство их идентичности, а также иногда для решения дополнительных задач по приданию продукту природного характера.
Тем не менее генно-инженерный способ относится к числу перспективнейших при получении многих белковых биологических веществ, ценных для медицины.
Таким образом, биотехнология проникла во все сферы науки и производства, стала незаменимой в жизни людей. Мы переживаем ее бурный расцвет, каждый день приносит новые результаты. Развитие биотехнологии во всех странах порождает конкуренцию на рынках сбыта. Так, сейчас за рынки сбыта генно-инженерных продуктов (вакцина против гепатита В, интерферон,
интерлейкин и др.) за рубежом конкурируют десятки и сотни фирм. Это определяет темпы развития, с одной стороны, а также служит движущей силой поиска и разработки новых продуктов для медицины, ветеринарии, промышленности — с другой. Будущее за биотехнологией, как наиболее природной и рациональной сферой в области производства многих жизненно ценных продуктов, в том числе медицинского назначения.
ГЛАВА 7. ПРОТИВОМИКРОБНЫЕ ПРЕПАРАТЫ
Сдерживание или прекращение роста микробов достигается различными методами (комплексами мер): антисептикой, стерилизацией, дезинфекцией, химиотерапией. Соответственно, химические вещества, которые применяются для осуществления этих мер, называются стерилизующими агентами, дезинфектантами, антисептиками и противомикробными химиопрепаратами. Противомикробные химические средства подразделяют на две группы: (1) не обладающие избирательностью действия — губительны в отношении большинства микробов (антисептики и дезинфектанты), но при этом токсичны для клеток макроорганизма, и (2) обладающие избирательностью действия (химиотерапевтические средства).
7.1. Химиотерапевтические препараты Химиотерапевтические противомикробные лекарственные средства - это
химические препараты, которые применяют при инфекционных заболеваниях для
этиотропного лечения (т. е. направленного на микроб как на причину болезни), а также(редко и осторожно!) для профилактики инфекций.
Химиопрепараты вводят внутрь организма, поэтому они должны губительно действовать на возбудителей инфекций, но при этом быть нетоксичными для человека и животных, т. е. обладать избирательностью действия.
Избирательное действие («селективная токсичность») — термин, предложенный немецким иммунохимиком, лауреатом Нобелевской премии Паулем Эрлихом, и характеризующий разную степень токсичности химиопрепарата для паразитов и для клеток организма хозяина. Для осуществления избирательности необходимо, чтобы противомикробный препарат действовал на такую мишень, которая есть у микроба, но отсутствует в клетках макроорганизма. Такие мишени легче подобрать для прокариотов (бактерий), так как у них гораздо больше отличий от клеток хозяина, чем у эукариотических микробов (грибы, простейшие). Наиболее отличаются от клеток хозяина вирусы, как не имеющие клеточных структур и собственного метаболизма. Тем не менее, выбрать мишени для селективного действия противовирусных препаратов оказалось чрезвычайно сложно, так как вирусы — облигатные внутриклеточные паразиты и, следовательно, противовирусные препараты должны осуществлять свое действие внутри клетки хозяина, не принося ей вреда.
В настоящее время известны тысячи химических соединений, обладающих антимикробной активностью, но лишь только несколько десятков из них применяются в качестве химиотерапевтических средств.
По тому, на какие микробы действуют химиотерапевтические препараты, определяют спектр их активности:
действующие на клеточные формы микроорганизмов (антибактериальные, противогрибковые, противопротозойные). Антибактериальные, в свою очередь, принято подразделять на препараты узкого и широкого спектра
действия: узкий— когда препарат активен в отношении только небольшого количества разновидностей или грамположительных, или грамотрицательных бактерий, а широкий — если препарат действует на достаточно большое количество разновидностей представителей обеих групп.
противовирусные химиопрепараты.
Кроме того, существуют некоторые антимикробные химиотерапевтические лекарственные средства, обладающие также
противоопухолевой активностью.
По типу действия различают химиопрепараты:
• «Микробоцидные» (бактерицидные, фунгицидные и т. п.), т. е. губительно действующие на микробы за счет необратимых повреждений;
• «Микробостатические», т. е. ингибирующие рост и размножение микробов.
К антимикробным химиотерапевтическим средствам относят следующие группы препаратов:
Антибиотики (действуют только на клеточные формы микроорганизмов; также известны противоопухолевые антибиотики).
Синтетические химиопрепараты разного химического строения (среди них есть препараты, которые действуют или на клеточные микроорганизмы, или на неклеточные формы микробов).
7.1.1.Антибиотики
Тот факт, что одни микробы могут каким-то образом задерживать рост других, был хорошо известен издавна. Еще в 1871—1872 гг. российские ученые В. А. Манассеин и А. Г Полотебнов наблюдали эффект при лечении зараженных ран прикладыванием плесени. Наблюдения Л. Пастера (1887) подтвердили, что антагонизм в мире микробов — это распространенное явление, однако природа его была неясна. В 1928-1929 гг. А. Флеминг открыл штамм плесневого гриба пеницилла (Penicillium notatum), выделяющего химическое вещество, которое задерживает рост стафилококка. Вещество было названо «пенициллин», однако лишь в 1940 г X. Флори и Э. Чейн смогли получить стабильный препарат очищенного пенициллина — первый антибиотик, нашедший широкое применение в клинике. В 1945 г А. Флеминг, X. Флори и Э. Чейн были удостоены Нобелевской премии. В нашей стране большой вклад в учение об антибиотиках внесли 3. В. Ермольева и Г Ф. Гаузе.
Сам термин «антибиотик» (от греч. anti, bios— против жизни) был предложен С. Ваксманом в 1942 г. для обозначения природных веществ, продуцируемых микроорганизмами и в низких концентрациях антагонистичных к росту других бактерий.
Антибиотики - это химиотерапевтические препараты из химических соединений биологического происхождения (природные), а также их полусинтетические производные и синтетические аналоги, которые в низких концентрациях оказывают избирательное повреждающее или губительное действие на микроорганизмы и опухоли.
7.1.1.1. Источники и способы получения антибиотиков Основными продуцентами природных антибиотиков являются
микроорганизмы, которые, находясь в своей естественной среде (в основном, в почве), синтезируют антибиотики в качестве средства выживания в борьбе за существование. Животные и растительные клетки также могут вырабатывать некоторые вещества с селективным антимикробным действием (например, фитонциды), однако широкого применения в медицине в качестве продуцентов антибиотиков они не получили.
Таким образом, основными источниками получения природных и полусинтетических антибиотиков стали:
Актиномицеты (особенно стрептомицеты) — ветвящиеся бактерии. Они синтезируют большинство природных антибиотиков (80%).
Плесневые грибы — синтезируют природные бета-лактамы (грибы рода
Cephalosporium и Penicillium) и фузидиевую кислоту.
Типичные бактерии — например, эубактерии, бациллы, псевдомонады — продуцируют бацитрацин, полимиксины и другие вещества, обладающие антибактериальным действием.
Существует три основных способа получения антибиотиков: биологический синтез (так получают природные антибиотики —
натуральные продукты ферментации, когда в оптимальных условиях культивируют микробы-продуценты, которые выделяют антибиотики в процессе своей жизнедеятельности);
биосинтез с последующими химическими модификациями (так создают полусинтетические антибиотики). Сначала путем биосинтеза получают природный антибиотик, а затем его первоначальную молекулу видоизменяют путем химических модификаций, например присоединяют определенные радикалы, в результате чего улучшаются противомикробные и фармакологические характеристики препарата;
химический синтез (так получают синтетические аналоги природных антибиотиков, например хлорамфеникол/левомицетин). Это вещества, которые имеют такую же структуру, как и природный антибиотик, но их молекулы синтезированы химически.
7.1.1.2. Классификация антибиотиков по химической структуре По химической структуре антибиотики сгруппированы в семейства
(классы):
бета-лактамы (пенициллины, цефалоспорины. карбапенемы, монобактамы)
Гликопептиды
аминогликозиды
тетрациклины макролиды (и азалиды) линкозамиды
левомицетин (хлорамфеникол) рифамицины полипептиды полиены
разные антибиотики (фузидиевая кислота, фузафунжин и др.)
Бета-лактамы. Основу молекулы составляет бета-лактамное кольцо, при разрушении которого препараты теряют свою активность; тип действия — бактерицидный. Антибиотики этой группы подразделяют на пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы и монобактамы.
Пенициллины. Природный препарат— бензилпеницилин (пенициллин G) — активен против грам-положительных бактерий, однако имеет много недо-статков: быстро выводится из организма, разрушается в кислой среде желудка, инактивируется пеницилли-назами — бактериальными ферментами, разрушающими бета-лактамное кольцо. Полусинтетические пенициллины, полученные путем присоединения к основе природного пенициллина — 6-аминопенициллановой кислоте — различных радикалов, имеют преимущества перед природным препаратом, в том числе широкий спектр действия:
•депo-препараты (бициллин), действует около 4 недель (создает депо в мышцах), применяется для лечения сифилиса, профилактики рецидивов ревматизма;
кислотоустойчивые (феноксиметилпенициллин), для перорального приема; пенициллиназоустойчивые (метициллин, оксациллин), но у них довольно
узкий спектр;
широкого спектра (ампициллин, амоксициллин); антисинегнойные (карбоксипенициллины — карбенициллин, уреидопенициллины
— пиперациллин, азлоциллин);
•комбинированные (амоксициллин + клавулановая кислота, ампициллин+сульбактам). В состав этих препаратов включены ингибиторы ферментов — бета-лактамаз (клавулановая кислота и др.), которые тоже содержат в своей молекуле бета-лактамное кольцо; их противомикробная активность очень низка, но они легко связываются с этими ферментами, ингибируют их и таким образом защищают молекулу антибиотика от разрушения.
Цефалоспорины. Спектр действия широкий, но более активны в отношении грамотрицательных бактерий. По последовательности внедрения различают 4 поколения (генерации) препаратов, которые отличаются по спектрам активности, устойчивости к бета-лактамазам и некоторым фармакологическим свойствам, поэтому препараты одного поколения не заменяют препараты другого поколения, а дополняют.
1-е поколение (цефазолин, цефалотин и др.) — более активны в отношении грамположительных бактерий, разрушаются бета-лактамазами;
2-е поколение (цефуроксим, цефаклор и др.) — более активны в отношении грамотрицательных бактерий, более устойчивы к бета-лактамазам;
3-е поколение (цефотаксим, цефтазидим и др.) — более активны в отношении грамотрицательных бактерий, высоко резистентны к действию бета-лактамаз; 4-е поколение (цефепим и др.) — действуют в основном на грамположительные, некоторые грамотрицательные бактерии и синегнойную
палочку, резистентны к действию бета-лактамаз.
Карбапенемы (имипенем и др.) — из всех беталактамов имеют самый широкий спектр действия и резистентны к бета-лактамазам.
Монобактамы (азтреонам и др.) — резистентны к бета-лактамазам. Спектр действия узкий (очень активны против грамотрицательных бактерий, в том числе против синегнойной палочки).
ГЛИКОПЕПТИДЫ (ванкомицин и тейкопланин) — это крупные молекулы, которым трудно пройти через поры грамотрицательных бактерий. Вследствие этого спектр действия ограничивается грамположительными бактериями. Их используют при резистентности или аллергии к бета-лактамам, при псевдомембранозном колите, вызываемом Clostridium difficile.
АМИНОГЛИКОЗИДЫ — соединения, в состав молекулы которых входят аминосахара. Первый препарат — стрептомицин — был получен в 1943 г. Ваксманом как средство для лечения туберкулеза. Сейчас различают несколько поколений препаратов: (1) стрептомицин, канамицин и др., (2)
гентамицин, (3) сизомицин, тобрамицин и др. Препараты бактерицидны,
спектр действия — широкий (особенно активны против грамотрицательных бактерий, действуют на некоторых простейших).
ТЕТРАЦИКЛИНЫ — это семейство крупномолекулярных препаратов, имеющих в своем составе четыре цикличных соединения. В настоящее время, в основном, применяют полусинтетики, например доксициклин. Тип действия
— статический. Спектр действия — широкий (особенно часто используются для лечения инфекций, вызванных внутриклеточно расположенными микробами: риккетсиями, Хламидиями, Микоплазмами, бруцеллами, легионеллами).
МАКРОЛИДЫ (и азалиды) — это семейство больших макроциклических молекул. Эритромицин — наиболее известный и широко используемый антибиотик. Более новые препараты: азитромицин, кларитромицин (их можно применять всего 1—2 раза в сутки). Спектр действия — широкий, включая внутриклеточные микроорганизмы, легионеллы, гемофильную палочку. Тип действия — статический (хотя, в зависимости от вида микроба, может быть и цидным).
ЛИНКОЗАМИДЫ (линкомицин и его хлорированный дериват — клиндамицин). Бактериостатики. Спектр их действия похож на макролиды, клиндамицин особенно активен против анаэробов.
ЛЕВОМИЦЕТИН (ХЛОРАМФЕНИКОЛ) имеет в составе молекулы нитробензеновое «ядро», которое, к сожалению, делает препарат токсичным не только в отношении бактерий, но для клеток организма человека. Статический тип действия. Спектр действия — широкий, включая внутриклеточных паразитов.
РИФАМИЦИНЫ (рифампицин). В основе препарата — крупная молекула со сложной структурой. Тип действия — бактерицидный. Спектр действия — широкий (в том числе внутриклеточные паразиты; очень эффективны против микобактерий). Сейчас применяют в основном только для лечения туберкулеза.