- •Химия белков.
- •1) Аналитическое ультрацентрифугирование – относится к
- •Оптические свойства.
- •Общие принципы выделения белков.
- •1)Спираль; 2)Складчатая структура; 3)Статистический клубок.
- •Классификация белков.
- •Ферменты.
- •Классификация ферментов.
- •Основы ферментативной кинетики.
- •Механизмы активирования.
- •Регуляция активности ферментов.
- •Основы клинической ферментологии.
- •Основные этапы обмена веществ.
- •Биохимия питания.
- •Витамины.
- •Рекомендации в области диеты.
- •Биоокисление.
- •Внутримитохондриальное окисление.
Основы ферментативной кинетики.
Кинетика – это раздел физической химии, изучающий скорости протекания реакций. Кинетические исследования лежат в основе понимания механизма реакции: во сколько стадий протекает химическая реакция, какова природа превращений на каждой стадии, какая стадия самая медленная, то-есть определяющая скорость суммарной реакции. Описание реакций в таких понятиях и называется механизмом реакции. Хотя скорости реакций определяются экспериментально, соотношение между скоростью и концентрациями реагентов можно выразить в виде простого уравнения. При записи таких уравнений используется константа скорости К. При постоянной температуре К – это постоянная, характеризующая быстроту протекания реакции. Большое значение для объяснния ферментативной кинетики имели работы Михаэлиса и Ментена. Они работали с дрожжевым экстрактом, содержащим инвертазу: сахароза = глюкоза + фруктоза (реакция идет под действием инвертазы). В одной серии опытов [S] = const, а количество фермента изменялось (отмечалась линейная зависимость), во второй – [F] = const, а [S] – изменялась (увеличивалась), при этом отмечалась нелинейная гиперболическая зависимость скорости от [S]. Для обьяснения полученных результатов предполагалось образование фермент- субстратного комплекса.
K1 K3
F + S FS P + F
K2
V1 = K1 [F] [S]
V2 = K2 [FS] На основании закона действующих масс.
V3 = K3 [FS]
Наиболее важна V3, так как дает продукт реакции. Но [FS] определить практически невозможно. Используют суммарное уравнение Михаэлиса – Ментена:
K3 [F0] [S] K2 + K3
\/ = Km =
Km + [S] , где K1
V3 – скорость приводящая к образованию продукта.
К3 – константа этой скорости.
[F0] – сумма фермента в свободном состоянии и в составе фермент-субстратного комплекса ([F] + [FS] ).
[S] – концентрация субстрата.
Кm – константа Михаэлиса.
Модель фермент-субстратного комплекса, построенная на основе лабораторных методов определения V3 при изменении [S] и при [F] = константа и приводящая к кинетическому уравнению Михаэлиса – Ментена и составляет основу ферментативной кинетики.
Константа Михаэлиса и максимальная скорость – кинетические параметры, отражающие механизм действия фермента, так что они являются основой для понимания того, как действует фермент. Еще большую информацию дают изменения константы Михаэлиса и (или) максимальной скорости, полученной вследствии изменений условий реакций, наличие другого субстрата или благодаря обработки фермента, приводящей к изменению его структуры.
Значение константы Михаэлиса и максимальной скорости находят путем анализа кинетических данных. Проанализируем уравнение Михаэлиса – Ментона:
1)Концентрация субстрата постоянна и намного больше концентрации фермента. В таком случае скорость реакции будет зависеть только от концентрации фермента и, если концентрация фермента будет приближаться к концентрации субстрата, то скорость реакции замедлится.
V3
[F0]
2) Допустим, что концентрация фермента постоянна и достаточно высока. Проанализируем в этих условиях уравнение Михаэлиса – Ментона:
а) Концентрация фермента намного больше константы Михаэлиса. Тогда в знаменателе [S] мы можем пренебречь; К3, константа Михаэлиса и [F0] – величины постоянные и выходит что скорость реакции зависит прямо пропорционально только от концентрации субстрата в числителе. Но это справедливо только для малых концентраций субстрата, что мы обговорим в предварительных условиях.
V3
[S]
б) Концентрация субстрата намного больше константы Михаэлиса. Тогда в знаменателе мы можем пренебречь константой Михаэлиса, концентрации субстрата в числителе и в знаменателе сокращаются и получается, что при значительных концентрациях субстрата скорость реакции от концентрации субстрата не зависит. Такую скорость называют максимальной (Vmax).
Vmax * [S]
V3 Следовательно: V3 =
Km + [S]
Так как полное насыщение фермента субстратом, то
Vmax = K3 * [FS] = K3 * [E0], то-есть [E0] = [FS],
Vmax так как [E] = 0
[S]
При достижении максимльной скорости происходит полное насыщение фермента субстратом. Максимальная скорость характеризует каталитическую силу фермента, а также активирующий эффект активатора и силу ингибитора. То-есть, по сути, максимальная скорость выражает эффективность действия фермента. Для сравнения каталитической активности различных ферментов максимальную скорость выражают через количество (в молях) каждого фермента. Такое преобразование приводит к величине, которую называют молярной активностью. Она выражается числом молей субстрата, реагирующего с одним молем фермента за единицу времени (за одну минуту или секунду). Например, карбангидраз, каталаза и так далее. Активнрсть фермента так же можно выражать в единицах ферментативной активности. Одна энергия катализирует превращение субстрата со скоростью 1мкмоль в минуту. Удельная активность – это ферментативная активность, отнесенная на 1 мг белка. Мы уже упоминали, что Км = (К2 + К3) / К1. Но, К1,2,3 нельзя определить практически, так как не известно сколько существует [FS]. Константу Михаэлиса можно рассчитать графически. Допустим , что \/3 = ½ \/мах, то-есть при 50% насыщения фермента субстратом, тогда \/мах/2=(\/мах х [S]) /(Km + [S]), то-есть 2[S]=Км+[S] Получается, что константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции равна ½ максимальной скорости. При этом связывается половина имеющегося фермента. Константу Михаэлиса выражают в единицах концентрции (моль). Для одномолекулярных реакций константа Михаэлиса равна десять в минус второй – десять в минус пятой степени моль.
Ферменты могут иметь одинаковые каталитические силы, но разные константы Михаэлиса. Константа Михаэлиса характеризует специфичность фермента к субстрату. Чем меньше константа Михаэлиса, тем выше специфичность, тем быстрее образуется фермент-субстратный комплекс, или фермент-субстратный комплекс быстрее распадается на продукт и фермент, или и то и другое. Активаторы и ингибиторы влияют на константу Михаэлиса и максимальную скорость.
Пример, гексакиназа (фермент, катализирующий превращение простых сахаров в фосфоэфиры). Для ее насыщения субстратом на 50% глюкозы требуется в 1000 раз меньше, чем аллозы.
О = С – Н О = С – Н
| |
Н – С – ОН Н – С - ОН
| |
HO – C – H H – C – OH
| |
H – C - OH H – C – OH
| |
H – C – OH H – C – OH
| |
CH2OH CH2OH
Глюкоза аллоза
\/3
-
\/мах -| - - - - - - - - |- - - -
|
_ _ _ |_ _ _ _ _ _ |
| |
| |
| |
| | [S]
Км Км2
Из этих дух графиков видно, что из этих двух ферментов более специфичен тот, который имеет меньшую величину константы Михаэлиса, так как в этих условиях быстрее достигается максимальная скорость реакции. Определить константу Михаэлиса можно и используя уравнение обратных величин (рассчитанное Лайнуивером - Бэрком), на основании которого строится одноименный график:
1 / \/3 Этот метод называеися методом двойных обратных величин
и основан на алгебраическом преобразовании исходного
уравнения гиперболы по Михаэлису-Ментону к уравнению
прямой.
1 / \/мах
- 1 / Км 1[S]
ИНГИБИТОРЫ ФЕРМЕНТОВ.
Активность ферментов зависит от действия активаторов и ингибторов ферментов. Соответственно, ингибиторы – это вещества, действие которых снижает активность ферментов, а активаторы – вещества, при действии которых активность ферментов повышается. Различают по специфичности: специфические (антитрипсин) и неспецифические; по месту действия: на активный центр, аллостерические.
Антибиотики, ативирусные агенты, противоопухолевые средства, инсектециды и гербициды – о существовании этих средств теперь знают все. Действие многих из них основаго на способности ингибировать (то-есть затормаживать) работу клеточных ферментов, обычно какого-то определенного фермента. Ингибирование ферментов происходит и в природе, представляя собой одну из систем биорегуляции. Ферменты никогда не работают монотонно. Их активность постоянно меняется и в значительной мере зависит от постоянно меняющихся условий внешней и внутренней среды.
Различают обратимое ингибирование: ингибитор + фермент (ингибитор – фермент) и необратимое ингибирование: ингибитор + фермент (ингибитор-фермент). В свою очередь обратимые ингибирование делят на конкурентное и неконкурентное. Конкурентное ингибирование основано на близости структур молекул ингибитора и субстрата, то-есть возникает конкуренция за фермент, за его активный центр. Например, субстратом для действия фермента сукцинатдегидрогеназы является янтарная кислота:
СООН СООН
| |
СН2 - H2 СН F – сукцинатдегидрогеназа.
| ||
СН2 F СН
| |
СООН СООН
Янтарная Фумаровая
кислота кислота
Сильнейшим ингибитором этого фермента является малоновая кислота (СООН – СН2 - СООН ): образуется комплекс (фермент-ингибитор), который не дает продукта реакции, так как не может идти дегидрирование. При этом уменьшается число молекул свободного фермета, способного взаимодействовать с субстратом и скорость понижается. Но этот вид ингибирования обратим, его можно пресечь постепенным насыщением среды субстратом, то-есть увеличением его концентрации, то-есть мы можем сделать вывод, что при конкурентном ингибировании существует прямая зависимость от концентраций субстрата и ингибитора. При конкурентном ингибировании максимальная скорость постоянна, но константа Михаэлиса увеличивается (то-есть снижается специфичность) и для достижения максимальной скорости нужно повышать концентрацию субстрата.
1 / \/3 не конкурентное ингибирование
-- конкурентное ингибирование
без ингибирования
1 / Км 1 / [S]
Зная принципы конкурентного ингибирования, можно искусственно находить (например, синтезировать) ингибиторы ферментов, что и используется на практике. Например, парааминобензойная кислота используется для синтеза фолиевой кислоты, необходимой для жизнедеятельности микроорганизмов. Ингибитором фермента, катализирующего эту реакцию является сульфаниловая кислота, которая входит в состав сульфаниламидных препаратов (сульфадиметоксин, сульфадимезин и т. д.). Введение этих препаратов ингибирует синтез фолиевой кислоты, не давая возможности жить и развиваться микроорганизмам.
COOH SO3H O
| | || N
HN __R
1 2 3
H2N
| |
NH2 NH2
1 – парааминобензойная кислота; 2 – сульфониловая кислота; 3 – фоливая кислота.
Тетрогидрофоливая кислота – это очень важный ко-фермент нескольких ферментов, участвующих в синтезе ДНК и РНК. При введении сульфаниламидных препаратов, немедленно наблюдается ингибирование фермента, катализирующего утилизацию парааминобензойной кислоты (ПАБК) при синтезе фолиевой кислоты. Пониженный уровень фолиевой кислоты приводит к уменьшению синтеза нуклеиновых кислот.
Окончательным результатом этих событий является гибель микроорганизмов. Или, на основе урацила получен препарат 5 – фторурацил, который используется для лечения опухолей, так как блокирует синтез нуклеиновых кислот.
О
| |
HN -- F 5 – фторурацил.
O
NH
Аллопуринол (применяется при лечении конкурентного ингибирования). В некоторых случаях конкурентным ингибированием можно объяснить ингибирующие действие конечного продукта на фермент,участвующий в синтезе этого продукта. Такой тип биорегуляции часто встречается, его называют – ингибирование конечным продуктом.
Неконкурентные ингибиторы взаимодействуют не со всем активным центром, а с отделными функциональными группами в каталитической зоне. Такие ингибиторы имееют химическое сродство к какой-либо функциональной группе. Например, ионы серебра, ртути являются тиоловыми ядами, то-есть блокируют тиогруппы. Цианиды – соли синильной кислоты, являются дыхательными ядами, они связывают двух- и трехвалентное железо в составе простетической группы сложных белков-ферментов. Могут связываться и другие группы (карбоксильная, гидроксо- и т.д.). Притаком виде ингибировании повышение концентрации субстрата (чтобы прекратить ингибирование) не эффективно. Этот вид ингибирования можно убрать, вытесняя ингибитор из фермента. Например, в случае действия тиоловых ядов, добавляют вещества, имеющие тиогруппу (тиолы), например, цистеин. При этом виде ингибирования константа Михаэлиса является постоянной, то-есть специфичность не меняется, но уменьшается максимальная скорость, то-есть снижается каталитическая сила. К такого рода ингибиторам относятся: иприт, люизит. Снижение каталитической силы фермента (то-есть уменьшение максимальной скорости) при неизменной константе Михаэлиса возможно в случае, когда субстрат имеет одинаковое сродство к ферменту и фермент-ингибиторному комплексу, а ингибитор – к ферменту и к фермент-субстратному комплексу. Если сродство субстрата и ингибитора к ферменту и соответствующему комплексу различно (а чаще бывает, что так и есть), то меняются и максимальная скорость и константа Михаэлиса. Это во многих случаях характерно для ингибирования конечными продуктами.
НЕКОНКУРЕНТНОЕ ИНГИБИРОВАНИЕ может быть и необратимым (ингибитор ковалентно связывается с ферментом или фермент-субстратным комплексом, необратимо меняя нативную конформацию). При этом виде ингибирования между ингибитором и ферментом существует очень высокое сродство. Например, монойодуксусная кислота (СН2 I – СООН ), необратимо блокируют тиогруппы за счет связи атома йода с атомом водорода, а атом серы прочно связывается с остатком – СН2СООН. При этом добавление тиолов не помогает, то-есть ингибирование является необратимым. Или например, ФОС (фосфоорганические соединения) блокируют многие ферменты (например, эстеразы и другие ), содержащие серин, образуя очень прочную связь. Это свойство используют в изготовлении БОВ (боевых отравляющих веществ: табун, зарин, зоман, \/-газы) и в сельском хозяйстве для борьбы с вредителями. Из лекарственных препаратов, действие которых основано на необратимом ингибировании, можно назвать пенициллин, который ингибирует действие одного из ферментов участвующих в сборке клеточной стенки бактерий. Клетки, не имеющие клеточной стенки (их называют протопласты) легко лизируются. Интенсивное и неосторожное использование антибиотиков привело к быстрой эволюции бактериальных штаммов, устойчивых к антибиотикам. Поэтому очень важен поиск и синтез новых антибиотиков, против которых бактерии еще не имеют устойчивости. Например, в 1981году открыт новый класс антибиотиков, монобактами, по структуре сходных с пенициллином. Еще один пример лекарственного средства, действие которого основано на ковалентной модификации фермента – аспирин.
Существует и бесконкурентное ингибирование (его можно рассматривать как разновидность не конкурнтного) – когда ингибитор связывается не с ферментом а с фермент-субстратным комплексом, образуя комплекс фермент-субстрат-ингибитор. Здесь всегда действие фермента будет аллостерическим, так как активный центр занят субстратом, и ингибитор присоединяется к ферменту не к активному центру, а к аллостерическим зонам, удаленных от активного центра. Это приводит к изменению конформации аллостерической зоны, кооперативно с ней меняется и структура активного цента, то-естьменяется структура всей молекулы, приводя к тому что комплекс фермент-субстрат-иннгибитор не распадается и не дает продукта реакции. При таком виде ингибирования меняется (уменьшается), специфичность и каталитическая сила фермента.
АКТИВАТОРЫ ФЕРМЕНТОВ.
Активаторы повышают активность ферментов в десятки, сотни раз. Активаторы бывают специфические и неспецифические. Например, хлорид натрия для амилазы специфический, ионы магния, марганец и цинк – неспецифические (есть целая группа: марганец- , магнийзависимых ферментов). Некоторые вещества для одних ферментов являются активаторами, а для других – ингибиторами (например, ионы меди для полифенолоксидазы – активатор, а для амилазы – ингибитор.