1) Аналитическое ультрацентрифугирование – относится к

седиментационным методам (от слова седиментация – осаждение под действием гравитационных сил). Принцип метода: на поверхность буферного раствора, помещенного в кювету, наносят тонкий слой белка и кювету помещают в ротор центрифуги. Вращение ротора происходит со скоростью от 100000 до 500000 оборотов в минуту. При этом молекулы белка как более плотные начинают перемещаться в направлении от оси вращения. Это регистрируется специальным оптической системой по показателю преломления, который выше в зоне белка. На основании результатов вычисляют коэффициент седиментации(S).

dx 1

S= ---- * ----------

dt W²Х

Где dx/dt – Скорость седимнетации

W – угловая скорость, выраженная в рад/сек.

X – расстояние от оси вращения до зоны белка.

За единицу коэффициента седиментации условно принята величина десять в минус тринадцатой степени секунд, называется сведбергом и обозначается S*

Получаются величины (для белка) в диапозоне от 1 до 200 сведберг.

2) Метод ионообменной хроматографии. Стеклянную колонку заполняют смолой, несущей группировки SO3HNa. Известно, что в кислой среде белки заряжаются положительно и способны вытеснять часть ионов Na, занимая их место. Затем через колонку пропускают элюент( жидкость, способную разрывать связь белка с анионом SO3H). Поскольку прочность связи с SO3H у разных белков различна, они выходят из колонки поочередно. Поэтому их легко выделить и определить их количество и молекулярную массу.

3) Метод гель-фильтрации. Колонку заполняют декстраном ( например, сефадексом), имеющим поры. При этом молекулы, имеющие большие размеры, или совсем не проникают, или проникают только в часть пор и вымываются из колонки раньше, чем мелкие молекулы. Таким образом можно разделить смесь белков и измерить их молекулярную массу.

4) Электронная микроскопия. В настоящее время электронная микроскопия дает разрешение в 20 ангстрем, что позволяет видеть белки. Подсчитывая число белковых глобул, можно получить приблизительную величину молекулярного веса. Для этого достаточно знать концентрацию белка в растворе и объем, который наблюдается в микроскоп.

5) Метод рентгеноструктурного анализа.

6) Метод электрофореза.

7) Физические методы всегда дают приближенные результаты, поэтому их лучше дополнять данными, полученными с помощью химических методов, основанных на определении концентрации вещества.

Размеры белковых молекул зависят от ряда факторов (число аминокислотных остатков в полипептидной цепи, молекулярный вес белка, наконец, его форма) и колеблется от 0,001 до 0,1 мкм , то-есть в принципе, соизмеримы с коллоидными частицами, и, соответственно обладают некоторыми свойствами, близкими к свойствами коллоидных растворов:

1)низкая скорость диффузии белков в растворах (при этом глобулярные белки более подвижны чем фибриллярные).

2)Высокая вязкость (увеличение вязкости белков плазмы крови создает дополнительную нагрузку на миокард). Вязкость белковых растворов связана с большой молекулярной массой, связями в белковых молекулах, и наличием гидратной оболочки.

3)Белки неспособны проходить через полупроницаемую мембрану. В участках с высокой концентрацией белка создается избыточное гидростатическое давление. Притягивая воду, белки создают онкотическое давление. Это очень важный фактор для перераспределения воды между сосудистым руслом и тканями. Изменение ( уменьшение) онкотического давления может привести к отекам, а увеличение может привести к увеличению объема циркулирующей крови.

4)Некоторые белки (особенно фибриллярные) способны к гемообразованию (например, коллаген – это повышает его прочность).

По форме белковые молекулы делятся на фибриллярные и глобулярные.

Фибриллярные белки – это устойчивые, как правило нерастворимые в воде и в разбавленных солевых растворах вещества. Располагаясь параллельно друг другу вдоль одной оси, полипептидные цепи образуют длинные волокна – фибриллы. Это основные структурные элементы соединительной ткани (коллаген, кератин, эластин). У глобулярных белков полипептидные цепи плотно свернуты в компактные сферические структуры. Большинство этих белков растворимы в воде и слабых солевых растворах. Это почти все ферменты, антитела, альбумины, гемоглобин. Некоторые белки принадлежат к промежуточному типу. Подобно фибриллярным, они состоят из длинных палочковидных структур, в тоже время они, как и глобулярные, растворимы в водных солевых растворах. Это миозин, фибриноген. Белки обладают и свойствами истинных растворов.

Растворимость. Большинство белков растворимы в воде и водных солевых растворах, образуя растворы высокомолекулярных соединений (истинные растворы), по своим свойствам напоминающие коллоидные, так-как размеры белковых молекул сопостовимы с размерами коллоидных частиц. Растворы белков устойчивы. Растворимость белка тем выше, чем больше гидрофильных групп на его поверхности . На растворимость белков влияет добавление солей: так альбумины хорошо растворимы в воде, глобулины растворяются в присутствии 5-10% KCl или NaCl. Присутствие соли уменьшает(ослабляет) внутренние ионные связи.

Факторы стабилизации белковых растворов:

1) Наличие заряда.

2) Высокая степень гидротации.

Наличие заряда обусловлено способностью к ионизации гидрофильных группировок аминокислот, входящих в состав белка. Это группы –СООН, -ОН, -SH, -NH2 и т.д. Основной фактор ионизации – величина pH среды. Чем щелочнее среда, тем больший отрицательный заряд приобретает белковая молекула. Это можно изобразить схемотично:

-СООН щелочная среда -СОО ^-

-ОН -О ^-

-SH >pH -S ^-

и наоборот, чем кислее среда, тем больше положительный заряд:

-NH2 кислая среда -NH3⁺

<pH

-NH2 -NH3⁺

В большей степени ионизации подвергают группы –СООН и –NH2, в меньшей –ОН и –SH –группы. То значение рН, при котором группы -СООН или –NH2 ионизированы на 50%, называется показатель ионизации(Рк). Для карбоксильных групп Рк=2-4, для аминогрупп 10-12. Появление заряда на белковой молекуле приводит к образованию ионных связей. Способность к ионизации обуславливает буферное свойство белков( (при защелачивании среды белки могут являтся донорами протонов – в основном за счет карбоксильных групп, при закислении среды белки являются акцепторами протонов, при этом Н+ присоединяется к аминогруппам). В щелочной среде белок ведет себя как анион, и если раствор такого белка поместить в постоянное электрическое поле, то он мигрирует по направлению к аноду. Напротив, в кислой среде белок ведет себя как катион и в постоянном электрическом поле двигается по направлению к катоду. Эти свойства белков использовал Тизелиус, который в 1937 году предложил новый метод разделения сложных белковых смесей – электрофорез. В медицине явление электрофореза широко используется. Он применяется для разделения белков в сыворотке крови на фракции, для введения лекарственных веществ и т.д. При определенном значении рН среды количество положительных и отрицательных зарядов становится равным(т.е. суммарный заряд молекул белка равен 0). Такое состояние белка называется изоэлектрическим. Значение рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой и обозначается Pi. Изоэлектрическая точка белков варьирует между значениями рН от 1 (для пепсина)до 10 (для гистонов).Для большинства белков изоэлектрическая точка лежит в более узких пределах: от 4 до 7. Снять заряд можно добавлением электролита или приближением рН к Pi (т.е., по сути, подкислением раствора).

Гидратация объясняется полярными взаимодействиями гидрофильных групп белков (-COOH,-OH,-SH,-NH2) с диполями воды, при этом вокруг молекулы белка образуется «водная шуба», которые препятствует взаимодействию молекул белка между собой. Гидратацию можно уменьшить, изменяя конформацию белка (то-есть нарушая третичную структуру) – убирая гидрофильнуые группы внутрь белковой молекулы или добавляя вещества, жадно поглощающие воду (спирт, соли серной кислоты). Таким образом, для осаждения белка необходимо снять заряд и убрать гидратную оболочку. Вязкость растворов белка во многом определяет его оптические свойства.