Общие принципы выделения белков.

Для изучения белка (будь то определение его структуры или биологических функций) первым делом необходимо выделить белок в чистом виде. Поскольку белковые вещества весьма чувствительны к повышению температуры и действию большенства химических реагентов (органических растворителей, кислот, щелочей и т.д.), обычные методы органической химии, применяемые для выделения того или иного вещества из смеси (нагревание, перегонка, возгонка, экстракция, кристаллизация и т.д.) оказались в случае белков неприемлимыми. Белки в этом случае подвергаются денатурации, теряя свою биологическую активность. Поэтому разработаны эффективные методы выделения белков в мягких условиях, при пониженной температуре (не более +4 по Цельсию) с применением щадящих нативную структуру химических реагентов. Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани), исследуемый материал тщательно измельчают, вплоть до разрушения клеточной структуры. Этот процесс называется гомогенизация. Для этого используются различного рода гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультрозвук, метод «азотной бомбы “ (клетки насыщаются азотом под давлением, затем резко сбрасывают давление, а выделяющийся газообразный азот как бы "взрывает“ клетки). На следующем этапе из полученного гомогената тканей белки экстрагируют. Для экстракции белков широко применяются различные буферные смеси с определенным значением рН, органические растворители (водные растворы глицерина, слабый раствор глюкозы), различные ферменты, расщепляющие белково-липидные и белково-белковые связи (додецилсульфат натрия, дезоксихалат натрия и т.д.). После достижения полной экстракции белков (то-есть перевода в растворенное состояние), приступают к фракционированию белков, то-есть разделению смеси белков на отдельные белки. Часто фракционирование сочетается с идентификацией. Для этого используются различные методы:

1) электрофорез (различные виды: на бумаге, на геле, высоковольтный и т.д.). 2) ультроцентрифугирование 3) иммуно-химический анализ (антиген+антитело)

4) различные виды хроматографии 5) гельфильтрация.

Для последующей очистки белков от низкомолекулярных примесей используются методы диализа, гельфильтрации, кристаллизации, ультрафильтрации и т.д. Все эти методы основаны на разной растворимости, разной осаждаемости, величине (диализ, гельфильтрация), разности зарядов (электрофорез, ионообменная хроматография). Иногда используют разную биологическую активность (это при фракционировании и очистке ферментов). Но об этом легко говорить, однако осуществить трудно. В общем случае необходима многостадийная обработка исходного материала, на каждой из этих стадий удаляется большая часть постороннего материала, присутствующего в образце после предидущей стадии разделения до тех пор, пока искомый белок не будет получен в чистом виде, без примесей. Универсальной методики выделения для всех белков не существует. Хорошим считается результат, когда очистка проходит 5-6 стадий. Например, выделение галоктозосвязывающего белка из кишечной палочки (участвует в транспорте галактозы через мембрану) включает следующие стадии:

1) гомогенизирование 2) осаждение протамином (для удаления ДНК иРНК)

3) осаждение сульфатом аммония (высаливание – снижает растворимость белка).

4) хроматография на целлюлозе

5) хроматография на гидроксил-апатите

6) хроматография на сефадексе

Для определения степени очистки расчитывают удельную активность белка или используют метод аналитического центрифугирования. Очень эффективные методы:

1) афинная хроматография (1968 год – Анфинсен и сотрудники) – основан на специфическом связывании антиген-антитело.

2) изоэлектрофокусировка – использует различие в изоэлектрической точке белков (обычно используют полиакриламидный гель или агарозу) – на гель наносят слой белка, который мигрирует через области с различными рН, до тех пор, пока не достигнет изоэлектрического состояния.

ОТКРЫТИЕ БЕЛКОВ В РАСТВОРАХ.

Для открытия белков в растворах используют цветные реакции или реакции осаждения.

Цветные реакции различают двух типов:

1)универсальные, когда реагент реагирует с пептидной связью (биуретовая, нингидриновая) – эти реакции характерны для всех белков.

2)специфические – когда реагент дает окрашенные производные с какими-то определенными аминокислотами (реакция Фоля – на серусодержащие аминокислоты, реакция Миллона – на тирозин, ксантопротеиновая – азотная кислота взаимодействует с ароматическими аминокислотами, вызывая их нитрование – появляется желтое окрашивание).

Реакции осаждения делятся на необратимые (по сути, это – необратимая денатурация) и обратимые (высаливание). О денатурации мы уже говорили. Для высаливания применяются большие концентрации нейтральных солей: NaCl; (NH4)2SO4; MgSO4. При этом происходит дегидротация и снятие заряда, что является необходимым условием высаливания. На процесс высаливания влияет ряд факторов: молекулярная масса белка, гидрофильность, заряд белка и т.д.

МЕТОДЫ КОЛЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ.

Для количественного определения белка в растворе широко используются методы, основанные на использовании оптических свойств белков.

1)Рефрактометрический метод ( прибор рефрактометр) – чем больше концентрация белка в растворе, тем на больший угол отклоняется луч света, пропущенный через раствор белка, что и фиксируется прибором.

2)Нефелометрический метод (прибор – нефелометр). Основан на свойстве белковых растворов рассеивать свет. Соответственно, чем выше концентрация белка в растворе, тем больше степень рассеивания света.

3)Спектрофотометрический метод (прибор – спектрофотометр). Основан на свойстве раствора белка поглощать свет в ультрофиолетовой части спектора. Чем больше белка в растворе, тем больше поглощение этим раствором ультрафиолетовых лучей, что и фиксируется прибором.

4)Поляриметрический метод (прибор – поляриметр). Основан на зависимости вращения плоскости поляризованного света, пропускаемого через белковый раствор, от концентрации белка.

5)Кроме методов, основанных на оптических свойствах белка, широко используется колориметрический метод. Суть метода: проводят цветную реакцию и через окрашенный раствор белка пропускают свет с определенной длинной волны. Часть света поглощается окрашенным раствором белка. Степень поглощения зависит от концентрации белка в растворе.

6)В тех случаях, когда невозможно прямое определение белка в растворе, используют азотометрический метод. То-есть определяют не белок, а азот в растворе. Зная, что среднее содержание азота в белке составляет примерно 16%, легко, определив количество азота, рассчитать, сколько в растворе содержалось белка.

СТРУКТУРА БЕЛКА.

Белки обладают сложной пространственной структурой. Обычно принято говорить о четырех уровнях структурной организации белковой молекулы.

1)Первичная структура определяется:

а)природой входящих в молекулу аминокислот;

б)относительным количеством входящих в молекулу аминокислот;

в)строго определенной аминокислотной последовательностью полипептидной цепи (или цепей). Если имеются простетические группы , их состав и количество также влияют на первичную структуру. Впервые первичную структуру для одного из белков (инсулина) определил в 1951 году Сенджер (потребовалось несколько лет). Он показал, что аминокислотная последовательность инсулина включает 51 аминокислоту. В 1975 году была установлена первичная последовательность аспартатаминотрансферазы (412 остатков). К настоящему времени известна аминокислотная последовательность примерно в 1500 белков. За прошедшее с тех пор время, методы исследования были значительно усовершенствованы и теперь определение аминокислотной последовательности вызывает меньше затруднений. Используя, в частности, автоматические секвенаторы, работающие с очень малыми количествами образца (10 в –12 степени моль). Расшифрована аминокислотная последовательность молекулы антитела альфа-глобулиновой фракции крови – установленная аминокислотная последовательность включает 1320 аминокислотных остатков! Необходимо отметить, что последовательность аминокислот закодирована в генах, поэтому при синтезе белка формирование первичной структуры происходит не спонтанно, а согласно информации, закодированной в генах. Для первичной структуры характерна видовая специфичность, то-есть каждый вид животных организмов имеет свою, неповторимую первичную структуру у белков, выполняющих одну и ту же функцию у разных видов. Например, инсулин человека, свиньи, собаки, коровы и так далее для каждого вида имеет свою последовательность аминокислот, хотя и выполняет аналогичную функцию. Поэтому введение инсулина каких либо животных человеку не дает биологического эффекта.

Высшие уровни структуры белков, в частности, общая конформация и биологическая активность белка тесно связаны и фактически определяется аминокислотной последовательностью. Это убедительно подтверждают синтез Меррифильдом фермента рибунуклеазы (124 аминокислотных остатка). Этот синтезированный фермент принял такую же конформацию, как и нативный фермент и обладал такой же биологической (ферментативной) активностью. Получено много подобных фактов и с другими синтетическими белками (пептидами).

Свидетельства другого рода накоплены на основании изучения серповидно-клеточной анемии – наследственной болезни, при которой способность эритроцитов связывать кислород снижается. Интактная молекула гемоглобина состоит из двух бэтта- цепей и двух альфа-цепей. Бэтта- цепь нормального гемоглобина взрослого человека в шестом положении содержит глутаминовую кислоту. В серповидных клетках (характерно измененной формы) – бэтта-цепь в шестом положении содержит валин. Все остальные аминокислоты в составе бэтта-цепи и альфа-цепи совершенно одинаковые. Несмотря на столь малое различие (при общем числе аминокислотных остатков равном 574), молекула гемоглобина S имеет сниженную спсобность связывать кислород, видимо из-за того, что молекулы гемоглобина S имеют тенденцию слипаться, образуя агрегаты большого размера, что и вызывает изменение формы эритроцитов и превращение их в серповидные. Деформированные эритриоциты могут задерживаться в узких кровяных сосудах, что еще больше снижает доставку кислорода в ткани. Они легко разрушаются, что вызывает анемию,

Но было бы неправильно считать, что каждый аминокислотный остаток в каждом белке необходим для сохранения нормальной структуры и функции белка. Это не так. Например, были выявлены многие варианты аминокислотных последовательностей гемоглобина, функционирующие нормально. Вероятно, можно употреблять понятие о «необходимых» (существенных) и «допустимых замещениях» (малосущественных) остатках аминокислот в полипептидной цепочке белка.

Исходя из изложенного, можно отметить важное значение первичной структуры белковых молекул:

1) определяет общую конформацию и биологическую активность белка,

2) Определяет видовую специфичность,

3) позволяет определять молекулярные патологии,

4)дает возможность синтезировать белок с заданными биологическим свойствами (впервые был синтезирован инсулин Сэнджером в 1964 году).

Как же определить первичную структуру. Прежде чем приступить к секвенироированию, обычно проводят некоторые важные предварительные исследования, для чего необходимо иметь очищенный препарат белка. Определяют:

1)Молярную массу и оценивают чистоту препарта,

а) колончатая хроматография (гельфильтрация – используется агароза или декстран);

б) электрофорез в полиакриламидном геле (применяется для разделения, очистки, оценки чистоты и для определения молекулярной массы );

в) аналитическое ультроцентрифугирование.

2) Определяет тип и число простетических групп. При секвенировании иногда их отделяют от белковой части.

3) Определяются внутри- и межмолекулярные дисульфидные связи и однвременно определяется число сульфгидрильных групп цистеина.

4)Белки, имеющие чтвертичную структуру, разделяют на отдельные полипептидные цепи (изменяют pH, обрабатывают поверхностноактивными веществами и так далее).

Природу и количество аминокислот, составляющих белок, определяют, проводя расщепление белка до отдельных аминокислот и затем анализируют эту смесь. Обычным методом расщепления служит кислотный гидролиз, или вместо соляной кислоты добавляют метансульфоновую кислоту. (12 –36 часов при температуре 100 – 110 градусов, чаще в атмосфере азота). Более мягкий метод – с использованием протеолитических ферментов (пептидаз), но здесь возможно «загрязнение» (кроме расщепления полипептида, они могут катализировать собственное расщепление). Качественно и количественно определяются аминокислоты с помощью хроматографии.

Определение последовательности аминокислотных остатков в полипептидной цепи обычно начинается с определения концевых остатков. С-концевую аминокислоту можно определить обработав полипетид гидразином (NH2 – NH2 ), который реагирует с гидроксильными группировками в составе пептидной связи, но не образует соединения с концевой карбоксильной группой. Вследствие этого концевую (С - концевую) аминокислоту можно выделить и идентифицировать, используя хроматографические методы. Другой метод – обработка полипептида карбоксипептидазой (выделяется из желудочного сока). Она довольно специфично отщепляет С- концевые остатки полипептида. Необходимо контролировать только скорость отщепления аминокислотных остатков

Аминопептидаза – атакует полипептидную цепь с другого конца. И карбоксипептидаза и аминопептидаза являются экзопептидазами, то-есть катализируют отщепление концевых аминокислотных остатков. Для идентификации N-концевой амино кислоты используют: реактив Сэнджера (2,4-динитрофторбензол), или реактив Эдмана (фенилизотиоционат) или дансилхлорид. Но именно при использовании реактива Эдмана расщепляется первая (а не несколько) пептидная связь.

NO2

_NO2

| |

| |

F N=C=S

2,4 – динитробензол Фенилизотионат

Однако, даже в случае использовании автоматического аминокислотного секвинатора, максимальное возможное число операций с использованием реактива Эдмана ограничено отщеплением 40 – 60 аминокислотных остатков. Полипептидные цепи же обычно гораздо длиннее. Например.141 аминкислотный остаток в альфацепи гемоглобина, 188 – в гормоне роста, 332 – в глицероальдегиддегидрогеназе. Поэтому, наилучшей является следующая стратегия: большие полипептиды расщепляются на несколько фрагментов. Каждый из которых затем выделяется и секвенируется с помощью реактива Эдмана. Для получения фрагментов используют эндопептидазы (трипсин – предпочтительно расщепляет пептидные связи, содержащие карбоксильные группы основных аминокислот: лизин, аргинин; химотрепсин – то же самое, только ароматических аминокислот: тирозин, фенилаланин, триптофан). Есть и химические реактивы, например, бромциан BrCN – расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильной группой метионина. Обычно фрагментирование проводят комбинированно, используя различные комбинации реагентов, чтобы достаточно точно определять последовательнсть фрагментов.

Несколько важных обобщений, касающихся определения амиокислотной последовательности: общей

1) Не существует одной частичной последовательности, для всех белков.

2) Была обнаружена каждая из комбинаций двух последовательно соединенных аминокислот.

3) Белки выполняющие разные функции, имеют разные последовательности

4) Белки со сходными функциями имеют похожие последовательности, однако это совпадение проявляется лишь в малой степени.

5) Одинаковые белки, выполняющие одинаковые функции, и выделенные из разных организмов имеют значительное сходство в последовательностях аминокислот.

6)одинаковые белки, выполняющие одинаковые функции и выделенные из организмов одного вида почти всегда обладают совершенно одинаковой последовательностью

2) Вторичная структура – определяется регулярно повторяющейся формой укладки полипептидных цепей в пространстве. Или, можно сказать, что это пространственная ориентация основной полипептидной цепи без учета различной по составу и конформации белковых цепей. Остов любой цепи:

R1 R2 R3

| | |

NH2-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH-COOH

Мы уже говорили о том, что атомы углерода и азота в пептидной связи находятся в одной плоскости и поэтому исключают вращение. А вот альфа-углеродный атом и его радикал находятся под углом к основной цепи, да еще альфа-углеродный атом является ассиметричным , что и обуславливает вращение. Специфический тип ориентации (то-есть вторичная структура) является результатом того или иного вида свободного вращения вокруг связей цепи, соединяющих альфа-углеродные атомы. В природных полипептидных полипептидных цепях обнаружены 3 основных вида структуры: