3.3. Підготовка днк для трансфекції

Бактеріальні колонії, які містили рекомбінантні плазміди на основі вектору pCMV6-XL5 було ізольовано та висіяно у 150 мл рідкого поживного середовища з додаванням ампіциліну. Культури інкубували при 37⁰С протягом 16 годин до досягнення культурою щільності 0,35-0,4 OD.

Для отримання плазмідної ДНК використовували набір для виділення та очищення плазмідної ДНК QIAGEN-tip 500-Max (QIAGEN). Процедуру виконували згідно протоколу. По закінченню вимірювали концентрацію отриманого матеріалу методом спектрофотометрії та зберігали його при -20⁰С.

3.4. Підготовка клітин HeLa до трансфекції

Культуру клітин HeLa вирощували у матрацах для культивування площею 75 см² з додаванням збагаченого середовища DMEM до досягнення конфлюентності 80%. Після чого вживане середовище відбирали, додавали 2 мл хелатуючого реагенту Versene та інкубували 20-30 сек для відокремлення адгезованих клітин від поверхні. Відокремлені клітини суспензували з додаванням 8 мл нового середовища.

Для підрахунку кількості клітин використовували ручний автоматичний лічильник клітин Scepter 2.0 Cell Counter (Millipore). Підрахунок проводили згідно інструкції до приладу. Відому кількість клітин розводили у збагаченому середовищі DMEM до концентрації 0,25*10⁶ клітин/мл.

Для трансфекції використовували 0,5*10⁶ клітин, які висівали у 10 мл поживного середовища у пластикових чашках Петрі (діаметр 8 см, площа поверхні 56,7 см²). Культури вирощували 24 години в умовах 5% СО₂, 100% вологості при температурі 37⁰С.

За дві години до трансфекції середовище у чашках з культурами замінювали свіжим.

3.5. Підбір оптимальних умов трансфекції

Оптимальну кількість клітин та умови для експерименту було підібрано експериментальним шляхом.

Для отримання оптимальних умов трансфекції було використано плазмідні ДНК pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/EPRS-H6, які кодують білки NPRL2 з міткою Flag та глутаміл-проліл-тРНК-синтетазу відповідно. Загальну кількість ДНК, 0,35 мкг, було вирахувано теоретично, відповідно до попередніх експериментів. У пластикових чашках Петрі (діаметр 35 мм, площа - 9,6 см²) протягом 24 годин вирощувалась культура клітин у кількості 0,2 млн клітин на чашку на момент посіву. Для трансфекції використовували набір Effectene Transfection Reagent. За інструкцією до набору було протестовано такі умови:

• відношення між плазмідними ДНК pc5FLAG/TUSC4 та pCMV6-XL5/EPRS-H6 — 1:1, кількість реагенту для транфекції Effectene — 25 мкл/1 мкг ДНК;

• відношення між плазмідними ДНК — 1:1, кількість реагенту для транфекції — 12,5 мкл/1 мкг ДНК;

• відношення між плазмідними ДНК — 1:1, кількість реагенту для транфекції — 6,75 мкл/1 мкг ДНК;

• відношення між плазмідними ДНК — 1:2, кількість реагенту для транфекції — 12,5 мкл/1 мкг ДНК;

• відношення між плазмідними ДНК — 1:3, кількість реагенту для транфекції — 12,5 мкл/1 мкг ДНК.

3.6. Трансфекція клітин лінії HeLa з використанням реагенту Effectene Transfection Reagent

Для трансфекції використовували 0,5 млн клітин при посіві на чашку Петрі діаметром 85мм (площа 56,7 см2), які культивувались 24 години в умовах 5% СО₂, 100% вологості при температурі 37⁰С. Загальна кількість ДНК складала 2 мкг.

Процес трансфекції проводили відповідно інструкції до набору Effectene Transfection Reagent. У 500 мкл буферу додавали 2 мкг ДНК у кількісному співвідношенні 1:2 та обережно перемішували. Потім додавали 16 мкл підсилювача (Enhancer) у співвідношенні 8 мкл підсилювача на 1 мкг ДНК, обережно перемішували та інкубували 5 хв при кімнатній температурі. Effectene додавали у кількості 13,5 мкл, тобто у співвідношенні 6,75 мкл на 1 мкг ДНК, перемішували піпетуванням та інкубували 10 хв за кімнатної температури. До культури суміш додавали по краплинах, рівномірно розподіляючи по всій площині.

Трансфіковані культури вирощували за умов 5% СО₂, 100% вологості при температурі 37⁰С протягом 48 годин.