- •Київський національний університет імені тараса шевченка
- •Оцінка взаємодії білка nprl2 з компонентами мультиферментного комплексу аміноацил-тРнк-синтетаз
- •Реферат
- •Перелік умовних скорочень
- •Огляд літератури розділ 1 Білок nprl2 та його біологічна роль
- •1.1. Ідентифікація гену tusc4
- •1.2. Білок nprl2 як продукт гену tusc4
- •1.3. Білок nprl2 у mTor-сигнальному шляху
- •Розділ 2 Мультиферментні комплекси аміноацил-тРнк-синтетаз
- •2.1. Мультисинтетазні комплекси вищих еукаріот
- •2.2. Неканонічні функції аміноацил-тРнк-синтетаз, компонентів мультиферментного комплексу mars
- •Експериментальна частина розділ 3 матеріали і методи досліджень
- •3.1. Матеріали та реактиви
- •3.2. Клітинна лінія
- •3.3. Підготовка днк для трансфекції
- •3.4. Підготовка клітин HeLa до трансфекції
- •3.5. Підбір оптимальних умов трансфекції
- •3.6. Трансфекція клітин лінії HeLa з використанням реагенту Effectene Transfection Reagent
- •3.7. Імунохроматографія з використанням матриксу, що містив іммобілізовані антитіла до мітки Flag
- •3.8. Вестерн-блот аналіз
- •3.9. Візуалізація результатів досліду
- •Результати та їх обговорення
- •4.1. Визначення оптимальних умов трансфекції клітин HeLa реагентом Effectene
- •4.2. Умови проведення трансфекцій
- •4.3. Ідентифікація взаємодії між метіоніл-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/mrs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/mrs.
- •4.4. Ідентифікація взаємодії між глутамініл-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/qrs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/qrs.
- •4.5. Ідентифікація взаємодії між аспартил-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/drs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/drs.
- •4.6. Ідентифікація взаємодії між лізил-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/krs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/krs.
- •4.7. Ідентифікація взаємодії між р43, несинтетазним компонентом макромолекулярного комплексу mars, та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/р43;
- •Висновки
- •Список використаної літератури
Експериментальна частина розділ 3 матеріали і методи досліджень
3.1. Матеріали та реактиви
У роботі було використано реактиви:
eкстракт дріжджів, бакто-триптон, агар (“Oxoid”, Великобританія), набір для виділення та очищення плазмідної ДНК QIAGEN-tip 500-Max (QIAGEN, Німеччина); реагенти для трансфекції клітин Effectene Transfection Reagent (QIAGEN, Німеччина); середовище DMEM, ембріональна теляча сироватка (FBS), суміш антибіотиків пеніциліну та стрептоміцину, L-глутамін, розчин, що містить хелатуючий агент ЕДТА - Versene (всі реагенти - Gibco, Life Technologies, США); поліакриламідні гелі для аналізу білків Any kD MiniPROTEAN TGX Gel; концентрований трис-гліциновий буфер без додецилсульфату натрію (BioRad, США); маркер молекулярної маси білків Pierce Unstained Protein Molecular Weight Marker (ThermoScientific, США); набір для переносу білків на нітроцелюлозну мембрану TransBlot Turbo Nitrocellulose Transfer Packs (BioRad, США); хемілюмінесцентний субстрат і проявник SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (ThermoScientific, США); натрію додецилсульфат, Triton X100, Tween 20%, гліцерол, бета-меркаптоетанол, інгібітори протеаз бензамідин і пефаблок (все - SigmaAldrich, США), знежирене сухе молоко.
Антитіла: AntiFLAG M2 (SigmaAldrich, США); AntiMouse HRP, AntiRabbit IgG (Chemicon, США); антитіла, які було отримано у лабораторії раніше - AntiR3 CHO_3pur, IgG MTS-T 14/04/85 , IgG1 Gln-DEAE 14/04/85, IgG anti cKRS DN lapin 117 25/04/02, IgG AspRS DN20 13/12/96, IgG anti human p43 Ct lapin 052 30/05/00.
Всі розчини готували на деіонізованій та вільній від нуклеаз воді.
Обладнання: ручний автоматичний лічильник клітин Scepter 2.0 Cell Counter (Millipore); СО2-інкубатор для культур клітин MCO20AIC (Sanyo, Японія); мікроцентрифуги Heraeus Pico 17 та Heraeus Fresco 21 (ThermoScientific, США), центрифугa Beckman J20 зі змінними роторами різного діаметру (Beckman, США); система візуалізації поліакрамідних гелів Gel Doc EZ System (BioRad, США); система напівсухого переносу білків на мембрану Trans Blot Turbo Transfer Starter System (BioRad); система для проведення інкубацій для Western-blot аналізу Bench-Pro 4100 Card Processing Station (Invitrogen); система Luminescent Image Analyzer LAS3000 (Fujifilm Life Science); ; спектрофотометр Varian «Сагу50» (Varian, США).
Плазмідну конструкцію pc5FLAG/TUSC4 люб'язно надав директор Центру хіміотерапії раку (Токіо, Японія) доктор Наойя Фуджіта, конструкції pCMV6-XL5/MRS, pCMV6-XL5/QRS, pCMV6-XL5/KRS, pCMV6-XL5/DRS, pCMV6-XL5/p43 – були створені, перевірені та очищені раніше у лабораторії.
3.2. Клітинна лінія
В якості експериментальної модельної системи було використано HeLa HC – безсмертна лінія клітин, отримана із ракової пухлини (карциноми) шийки матки. Клітини інкубували в середовищі DMEM з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки, 2мМ L-глутаміну та суміші антибіотиків пеніциліну (50 од/мл) та стрептоміцину (50 мкг/мл) в умовах 5% СО2, 100% вологості при температурі 370С.