- •Київський національний університет імені тараса шевченка
- •Оцінка взаємодії білка nprl2 з компонентами мультиферментного комплексу аміноацил-тРнк-синтетаз
- •Реферат
- •Перелік умовних скорочень
- •Огляд літератури розділ 1 Білок nprl2 та його біологічна роль
- •1.1. Ідентифікація гену tusc4
- •1.2. Білок nprl2 як продукт гену tusc4
- •1.3. Білок nprl2 у mTor-сигнальному шляху
- •Розділ 2 Мультиферментні комплекси аміноацил-тРнк-синтетаз
- •2.1. Мультисинтетазні комплекси вищих еукаріот
- •2.2. Неканонічні функції аміноацил-тРнк-синтетаз, компонентів мультиферментного комплексу mars
- •Експериментальна частина розділ 3 матеріали і методи досліджень
- •3.1. Матеріали та реактиви
- •3.2. Клітинна лінія
- •3.3. Підготовка днк для трансфекції
- •3.4. Підготовка клітин HeLa до трансфекції
- •3.5. Підбір оптимальних умов трансфекції
- •3.6. Трансфекція клітин лінії HeLa з використанням реагенту Effectene Transfection Reagent
- •3.7. Імунохроматографія з використанням матриксу, що містив іммобілізовані антитіла до мітки Flag
- •3.8. Вестерн-блот аналіз
- •3.9. Візуалізація результатів досліду
- •Результати та їх обговорення
- •4.1. Визначення оптимальних умов трансфекції клітин HeLa реагентом Effectene
- •4.2. Умови проведення трансфекцій
- •4.3. Ідентифікація взаємодії між метіоніл-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/mrs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/mrs.
- •4.4. Ідентифікація взаємодії між глутамініл-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/qrs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/qrs.
- •4.5. Ідентифікація взаємодії між аспартил-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/drs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/drs.
- •4.6. Ідентифікація взаємодії між лізил-тРнк-синтетазою та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/krs;
- •4, 7, 10 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag та pCmv6-xl5/krs.
- •4.7. Ідентифікація взаємодії між р43, несинтетазним компонентом макромолекулярного комплексу mars, та білком nprl2
- •2, 5, 8 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pSg5;
- •3, 6, 9 — Культури клітин, котрансфікованих векторами pc5flag/tusc4 та pCmv6-xl5/р43;
- •Висновки
- •Список використаної літератури
Огляд літератури розділ 1 Білок nprl2 та його біологічна роль
1.1. Ідентифікація гену tusc4
Розвиток злоякісних пухлин з епітеліальних тканин є найбільш поширеним типом раку і вирізняється найвищим рівнем летальності. За даними Всесвітньої організації охорони здоров'я у 2012 році від раку померло близько 8,2 мільйонів людей, з них 1,59 мільйона від раку легень (19,4%), печінки — 0,8 мільйона (9,1%), шлунка — 0,7 мільйона (8,8%) та 0,5 мільйона (6%) від раку молочної залози [5]. Через актуальність даної проблеми є необхідним вивчення процесу розвитку різних видів раку та створення дієвих методів лікування.
Рак легенів розвивається внаслідок багатостадійного процесу, що включає безліч генетичних та епігенетичних змін домінантних онкогенів та генів-супресорів пухлин. Деякі з них можуть бути знайдені у клітинах епітелію, який ушкоджується під час паління, а також у фенотипово нормальних, неушкоджених клітинах. Для подальшої роботи з такими типами захворювань необхідно детально описати геном перероджених клітин. Найважливішою інформацією є ідентифікація потенційних онкогенів та генів-супресорів.
Дані багатьох досліджень свідчать, що делеція ділянки хромосоми у регіоні 3р21.3 спостерігалась при вивченні деяких видів раку, зокрема раку легенів, молочної залози, шийки матки, яєчників та нирок [6–9]. Так, при аналізі геному траснформованих клітин легенів та молочної залози було визначено ділянки розміром у 630 та 120 тисяч пар нуклеотидів відповідно, втрата яких призводить до їх трансформації [6,10,11]. Ці ділянки було проналізовано та знайдено 9 генів, які вважають потенційними супресорами пухлин: делеції чи мутації цих генів є типовими для ракових клітин. Серед цих генів було знайдено і TUSC4 (потенційний супресор пухлин 4).
1.2. Білок nprl2 як продукт гену tusc4
Білок NPRL2 – продукт гену TUSC4; у вигляді різних сплайсованих форм у нормі експресується у багатьох типах тканин, включаючи серцевий та скелетні м'язи, головний мозок, нирки, печінку та легені. Найбільш поширеною формою є білок, який складається із 380 амінокислотних залишків та кодується мРНК, яка містить 11 екзонів. Біоінформатичними методами було передбачено, що NPRL2 містить сигнал ядерної локалізації, домен зв'язування — гранулін, ділянку, що має схожість із білком MutS та домен-регулятор пермеази азоту [10].
Порушення експресії та функціонування білка NPRL2 пов'язують із багатьма видами раку. Деякий час вважалось, що у трансформованих клітинах присутні відмінні від нормальних форми сплайсованих РНК. Проте, наступні дослідження показали, що клітини пухлин містять безсенсові та міссенсові мутації кодуючого гена[12]. Незважаючи на встановлений факт супресії, механізм NPRL2-опосередкованого впливу на пухлину і досі залишається невідомим. Останні дослідження показали, що NPRL2 бере участь у репарації місметчів ДНК на стадії перевірки клітинного циклу, у регуляції апоптозу [12–14]. Надлишкова експресія NPRL2 в деяких пухлинних клітинних лініях, як повідомлялося, індукує апоптоз і пригнічує проліферацію [13]. Білок NPRL2 виконує ще одну важливу функцію як один із учасників mTOR-сигнального шляху [15].