Лабораторна робота № 4.3.
Вивчення постійних мікропрепаратів тканин нервової системи
Рисунок 9 Мозок
Вивчення функціональної диференціації клітин
Рисунок Тимус , тонкий зріз, оптичне
мікрофото
Вивчення постійних мікропрепаратів тканин нервової системи та залоз.
Теоретичні відомості
Контрастування корпускулярних об'єктів
Корпускулярними об'єктами можна назвати частинки вірусів, фагів, виділені клітинні компоненти (рибосоми, мембрани, вакуолі і т.д.), макромолекули.
Одним з широко розповсюджених методів контрастування біологічних об'єктів є оттенение металами. В цьому випадку в спеціальних вакуумних установках проводиться термічне випаровування металу. При цьому атоми металу розлітаються від місця випаровування за прямими траєкторіях. Зустрічаючись з об'єктом, вони осідають на ньому у вигляді шару, його товщина буде більше в місцях, перпендикулярних напрямку польоту частинок металу. У ділянках, де об'єкт екранує пучок частинок, виникнуть «тіні». Таким чином, напилення частина об'єкта має більшу щільність, ніж напилення підкладка (фон), і тому об'єкт буде видно. Цей метод широко застосовується не тільки для контрастування вірусів, рибосом, а й для досить тонких молекул нуклеїнових кислот. Мінус цього методу в тому, що він приводить до збільшення розмірів об'єкта на товщину напиленого шару, який в кращому випадку досягає 10-15 А. Інший недолік його в тому, що він дає інформацію тільки про зовнішній вигляд і обсязі частинок. Для контрастування оттенением використовується платина, паладій, їх сплави, уран.
Обладнання, матеріали і методи.
Мікроскопи, предметні скельця, скельця з лункою, скляні палички, петлі, покривні скельця. піпетки градуйовані на 2мл, 5 мл, 10мл, камера Горяєва, пробірки, чашки Петрі, мірні колби на 100 – 200 мл
Мікропрепарати – тонкі зрізи тканин людини та тварин
Порядок виконання роботи і рекомендації
Отримати постійні препарати – тонкі зрізи тканин тварин та людини
При наявності фарбованих за різними методиками препаратів, підготувати до мікроскопії всю групу зрізів.
Налаштувати освітлення і зображення в мікроскопі.
Мікроскопувати зразки на різних ступенях збільшення.
При дослідженні внутрішньої структури клітин слід віддавати перевагу найбільшому ступеню збільшення, що забезпечує імерсійний об’єктив х90.
При роботі з групою зрізів візуалізувати одну й ту саму ділянку, використовуючи кілька препаратів що фарбовано за різними методиками.
Мікрозображення занести в протокол лабораторної роботи, додати масштабну лінійку.
Для перевірки масштабу зображень провести калібрування за сіткою камери Горяєва.
В кінці роботи ретельно видалити залишки імерсійної олії з об’єктиву мікроскопа і препаратів.
Контрольні запитання
Прокаріотична та еукаріотична клітина: які їх спільні риси, чим відрізняються?
Порівняти тваринну та рослинну клітини.
Субклітинні елементи.
Підготовка проб для мікроскопії в клітинній біології: основні підходи.
Лабораторна робота № 4.4.
Вивчення постійних мікропрепаратів крові, лімфоїдних тканин
Мета роботи
Вивчення функціональної диференціації клітин
Завдання
Вивчення постійних мікропрепаратів крові, лімфоїдних тканин
Теоретичні відомості
Ультрамікротомія
При вивченні об'єктів в електронному мікроскопі виникає ще одне ускладнення - це їх товщина. Справа в тому, що при проходженні пучка електронів через об'єкт частина електронів поглинається, що приводить до нагрівання об'єкта і до його деформації. Тому необхідно мати тонкі об'єкти (не вище 0,1 мкм). Інше обмеження полягає в тому, що навіть якщо ми будемо розглядати незмінних об'єкти великої товщини (близько 0,5-1 мкм), що в принципі можливо (наприклад, в мегавольтной електронному мікроскопі, див. нижче), то на кінцевому зображенні будуть нашаровуватися проекції структур, розташованих на різних рівнях по товщині об'єкта. Тим самим вивчати в трансмісійних мікроскопах внутрішню будову цілих клітин погано і незручно. Вихід із цього становища аналогічний тому, що було знайдено для світлової мікроскопії, - робити зрізи дуже малої товщини, ультратонкі зрізи (0,05-0,10 мкм). Процедура їх виготовлення в принципі подібна стій, що використовується в світловій мікроскопії. Клітини і тканини для цього спочатку фіксують. В якості фіксаторів використовуються буферні розчини глутарового альдегіду або чотириокису осмію. Найбільш часто застосовується подвійна фіксація: спочатку глутаровий альдегід, а потім осмій, який як важкий метал контрастує клітинні структури. Потім, після зневоднення, тканини просочуються епоксидними смолами або іншими пластиками в рідкою, мономерний формі. При полімеризації таких пластмас просочений ними об'єкт виявляється ув'язненим в тверді блоки, які вже можна різати на тонкі зрізи. Тут виникають дві проблеми: де взяти ідеальні ножі, вади яких не позначалися б при вивченні клітин на майже молекулярних рівнях, і як виготовити зрізи товщиною в соті частки мікрона. Перша задача була вирішена таким чином: виявилося, що ідеально гострою і без зазубрин ріжучої поверхнею володіють відколи скла. Але скляні ножі дуже недовговічні, їх використовують тільки один раз. Застосовують алмазні ножі: це спеціальним чином заточені дрібні алмази, вони служать протягом декількох років.
Рисунок Бронх, тонкий зріз, оптичне
мікрофото
Обладнання, матеріали і методи.
Мікроскопи, предметні скельця, скельця з лункою, скляні палички, петлі, покривні скельця. піпетки градуйовані на 2мл, 5 мл, 10мл, камера Горяєва, пробірки, чашки Петрі, мірні колби на 100 – 200 мл
Мікропрепарати – тонкі зрізи тканин людини та тварин
Порядок виконання роботи і рекомендації
Отримати постійні препарати – тонкі зрізи тканин тварин та людини
При наявності фарбованих за різними методиками препаратів, підготувати до мікроскопії всю групу зрізів.
Налаштувати освітлення і зображення в мікроскопі.
Мікроскопувати зразки на різних ступенях збільшення.
При дослідженні внутрішньої структури клітин слід віддавати перевагу найбільшому ступеню збільшення, що забезпечує імерсійний об’єктив х90.
При роботі з групою зрізів візуалізувати одну й ту саму ділянку, використовуючи кілька препаратів що фарбовано за різними методиками.
Мікрозображення занести в протокол лабораторної роботи, додати масштабну лінійку.
Для перевірки масштабу зображень провести калібрування за сіткою камери Горяєва.
В кінці роботи ретельно видалити залишки імерсійної олії з об’єктиву мікроскопа і препаратів.
Контрольні запитання
порівняти мікротом, ультрамікротом.
Що таке імерсійна система?
Вкажіть товщину зрізів, що отримують на мікротомі та ультра мікротомі.
Рисунок
6. Ендоплазматичний ретикулум, електронна
мікрофотографія,
збільшення х 65 000
Обладнання, матеріали, посуд, інвентар для вивчення біології клітини.
Газовий хроматограф.
Полярограф.
Мікроскопи (ЛОМО (Микмед-1 з об’єктивом 75х – 80х, імерсійними об’єктивами) – 10 шт.
Масштабна сітка для окуляра мікроскопа – 10 шт.
Окулярний мікрометр – 10 шт.
Для забарвлення живих мікробних клітин потрібні барвники – нейтральний червоний, нейтральний фіолетовий, митіленовий синій, фуксин, еозін, ерітрозін, зелений янус у концентраціях – 0,001 – 0,0001%.
Щоб дослідитириродну форму, величину, будову мікроорганізмів, їх окремих структур (позаклітинна слизь) використовують негативні препарати – рідку туш, 3% водний розчин конго червоного, 10% розчин нігрозину і інші барвники які не проникають в мікробні клітини.
Для забарвлення ядер використовують основні барвники – червоного кольору (фуксин основний, сафранін, тіонін), сині (Вікторія, мітіленовий синій), фіолетові (генциан фіолетовий, кристалічний фіолетовий), зелені – малахітовий зелений, метиленовий зелений), чорний (індулін).
Розчин судану 3.
Льодова оцтова кислота.
Хлороформ.
Формалін.
Карболова кислота (фенол).
Карболовий фуксин Циля.
Гліцерин.
Танін.
Бром тимоловій синій
Покривні скельця – 3 упаковки. Предметні скельця – 100 шт. Сірники – 10 упаковок.
Марля. Шматки тканини.
Соляна кислота.
Мікробіологічні петлі – 15 шт.
Спиртівки – 15 шт.
Спирт – 5 л.
Піпетки градуйовані на 2мл, 5 мл, 10мл – по 20 шт.
Піпетки на 50мл, 100мл – по 7 шт.
Камера Горяєва – 7шт.
Пробірки – 50 шт.
Чашки Петрі – 50 шт.
Мірні колби на 100 – 200 мл – 15 шт. Мікробні культури -
Йод – 3 г.
Кохери – 15 шт.
Колби 2л, 3л, 5л. – по 5 шт.
Скляні бутиля – 5л, 10л, 20л – по 5 шт. Олівець по склу – 2 шт.