6.В-лимфоциты,развитие и дифференцировка.Функция в-лимфоцитов,субпопуляции в-лимфоцитов.

Все клетки крови, в том числе и лимфоциты, возникают из гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), которые находятся у эмбрионов в печени и костном мозге, а у взрослых только в костном мозге. Из ГСК под влиянием различных цитокинов возникают предшественники лимфоцитов (Т- и В-типа), а также других лейкоцитов и эритроцитов. Лимфоциты неоднородны. Различают две их популяции: Т-лимфоциты, которые дифференцируются в тимусе («тимусные») и В-лимфоциты, созревающие в костном мозге. В-лимфоциты происходят из ГСК и дифференцируются в эмбриональной печени, затем в костном мозге. В-1 субпопуляция возникает вне костного мозга из лимфоидной стволовой клетки (ЛСК) и локализуется в брюшной и плевральной полостях, сальнике, миндалинах. Она активно участвует в реакциях врожденного иммунитета, контролируя образование естественных антител. Маркер субпопуляции – молекула CD5. В-2 субпопуляция – обычные В-лимфоциты, они имеют на поверхности Ig-рецепторы для распознавания антигена. При стимуляции антигенами они созревают в плазмоциты, секретирующие иммуноглобулины – антитела.В норме в крови у человека содержится 17-30% В-клеток от общего числа лимфоцитов.

7.Методы определения субпопуляций клеток иммунной системы.Проточная цитометрия для оценки субпопуляции лимфоцитов.

Характеристика Т-лимфоцитов .1. Определяют общее количество лейкоцитов, формулу крови и количество лимфоцитов. В норме лимфоцитов 20-36% среди других лейкоцитов (около 2000 клеток в 1 мм3 крови). 2. Подсчитывают процент и количество Т-лимфоцитов. В норме среди лимфоцитов крови их 50-70% (1000-1400 клеток в 1 мм3 крови). Простой метод определения Т-клеток: подсчет количества(процента) лимфоцитов, образующих при помощи CD2-АГ розетки с эритроцитами барана: к взвеси лейкоцитов добавляют равный объем 1% взвеси отмытых эритроцитов барана и инкубируют при 370С 15 мин и ночь при 40С; осадок ресуспензируют, добавляют раствор глютарового альдегида до конечной концентрации 0,06% для фиксации розеток и сразу делают мазки; мазки высушивают, фиксируют спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимзе; подсчитывают процент Т-лимфоцитов, связавших три и более эритроцитов.В настоящее время общую популяцию Т-лимфоцитов выявляют с помощью меченых моноклональных антител к СD-антигенам (СD2, СD3) в реакции иммунной флюоресценции или в реакции с частицами, покрытыми такими антителами. В норме у человека в крови среди всех лимфоцитов 55-80% являются Т-клетками. 3. Определяют содержание Т-хелперов и Т-супрессоров с помощью моноклональных антител к СD4 (Тx) и СD8 (Тc) антигенам. У человека в норме в крови обнаруживается 33-46% Тx, 17-25% Тc, соотношение Тx/Тc=1,4-2.0 – иммунорегуляторный индекс. При заболеваниях этот индекс изменяется. Например, при СПИДе он уменьшается (0,04), т.к. угнетаются Тx (рецептором для вируса СПИДа является антиген Тx СD4). При аутоиммунных и аллергических заболеваниях индекс больше 2.0. Характеристика В-лимфоцитов .1. Общее количество В-лимфоцитов можно определить с помощью моноклональных антител к антигенам СD19-СD22, СD72. Применяют также антитела к иммуноглобулинам, которые находятся на поверхности В-лимфоцитов. В-лимфоциты составляют 17-25% всех лимфоцитов (600-800 клеток в 1 мм3 крови). Иногда определяют В-лимфоциты, имеющие рецепторы к эритроцитам мыши (10-15%), составляющие лишь часть В-субпопуляции. 2. Продукты В-лимфоцитов – иммуноглобулины G, М, A классов в сыворотке крови и различных биологических жидкостях определяют с помощью радиальной иммунодиффузии в агаре – реакции преципитации по Манчини. Для этого на одну стеклянную пластинку (или чашку Петри) наливают 2% агар, смешанный с антителами против IgG; на вторую пластинку – с антителами против IgМ, на 3-ю – против IgА. После застывания в агаре делают лунки диаметром 2 мм. В один ряд лунок каждой пластины вносят стандартную сыворотку с известной концентрацией IgG, IgМ, IgА. В другие лунки добавляют исследуемые сыворотки крови больных. Иммуноглобулины диффундируют в агар и на месте встречи с антителами, которые находятся в агаре, образуется зона кольца преципитации. Диаметр этого кольца зависит от концентрации Ig (чем больше Ig, тем больше диаметр). Измеряют диаметр зоны преципитации для трех разведений стандартной сыворотки и по ней на полулогарифмической бумаге строят график зависимости квадрата диаметра кольца преципитации (Д) от количества Ig в сыворотке крови. Затем измеряют диаметр кольца преципитации исследуемой сыворотки, наносят на построенный график и определяют концентрацию иммуноглобулина. Нормы у взрослых: 0,8-2 г/л IgM; 8,0-13,0 г/л IgG; 1,4-3,0 г/л IgA.