бх методическое указание

Методические указания к лабораторным занятиям по дисциплине биохимия разработаны на основании рабочей программы дисциплины биохимия, одобренной Ученым Советом лечебного факультета (председатель профессор И.Р. Рахматуллина) «26» апреля 2012 г., протокол № 3, и утвержденной «27» апреля 2012 г. ректором ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России профессором В.Н. Павловым.

Авторы: доцент кафедры биологической химии Кулагина И.Г., доцент кафедры биологической химии Карягина Н.Т.

Рецензенты: доцент кафедры биологической химии Абдуллина Г.М. профессор кафедры биологической химии Аглетдинов Э.Ф.

Утверждено на заседании кафедры биологической химии

«13 » июня 2012 г. (протокол № 465)

Лабораторное занятие №1.

Тема и ее актуальность. «Строение и функция белков. Методы качественного и количественного анализа белков».

2. Цель занятия. Овладеть некоторыми методами качественного и количественного ана-лиза белков, освоить правила работы с биологическим материалом, научиться произво-дить измерения оптической плотности на фотоэлектроколориметре.

В результате освоения темы студент должен уметь:

Количественно определять белок сыворотки крови биуретовым методом, последова-тельность измерения оптической плотности растворов на фотоэлектроколориметре.

Для формирования умений студент должен знать:

Способы укладки нативного белка; связи, стабилизирующие первичную, вторичную третичную и четвертичную структуры белка, сущность метода фотометрирования.

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы:

3.1Вспомнить элементный состав белков живых объектов.

3.2Описать функциональное многообразие белков. Привести примеры

3.3Дать определение первичной структуры белка.

3.4Представить определение вторичной структуры белка, ее разновидности, характеристика связи, стабилизирующей вторичную структуру.

3.5Третичная структура белка. Связи, стабилизирующие третичную структуру.

3.6Четвертичная структура белка. Приведите примеры белков, имеющих четвертичную структуру.

3.7Принципы количественного определения белка по белковому азоту и биуретовым методом.

3.8Границы нормального содержания белка в сыворотке крови у взрослых здоровых людей и детей.

3.9Схема фотоэлектроколориметра, принцип действия и последовательность операций при работе на этом приборе.

4. Вид занятия: лабораторное занятие

5. Продолжительность: 4 часа.

6. Оснащение: таблицы, плакаты, лабораторная посуда, термостат. 7. Содержание занятия.

7.1Контроль исходного уровня знаний и умений ( тесты).

Задание 1. Выберите наиболее правильный ответ.

…придают белкам основный характер.

а) цистеин и метионин в) аргинин и лизин с) триптофан и фенилаланин

Задание 2. Установите соответствие буквенных и цифровых положений.

Структура белка – стабилизирующие связи.

Задание 3. Подберите сочетания правильных ответов. N-концевую аминокислоту позволяют определить…

1)гидразин

2)динитрофторбензол

3)карбоксипептидаза

4)фенилизотиоцианат

5)Восстанавливающие агенты (NаВН4 )

Задание 4. Определите правильность утверждений в предложении и установите наличие причинной связи между ними.

При установлении аминокислотной последовательности проводится кислотный, а не основный гидролиз белка, так как в щелочной среде происходит разрушение некоторых аминокислот.

7.2.Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия. 1. первичная структура белка (дайте определение); 2. вторичная структура белка, ее разновидности; связи, стабилизирующей вторичную структуру.

3. супервторичная структурабелка 4. третичная структура белка, связи, стабилизирующие третичную структуру.

5. четвертичная структурабелка, примеры белков, имеющих четвертичную структуру.

6.методы исследования первичной структуры белка (методы гидролиза и хроматографического анализа); 7. принцип количественного определения белка биуретовым методом.

8. границы содержания белка в сыворотке крови в физиологичеких условиях.

7.3.Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя (лабораторная работа, оформление результатов проведенных лабораторных работ).

Реактивы: 0,9% раствора хлорида натрия, биуретовый реактив, стандартный 10% р-р альбумина.

Работа № 1. Количественное определение белка сыворотки крови биуретовым методом.

Клинико-диагностическое значение. Сыворотка крови содержит смесь белков, различных по физиологическому значению, структуре и физико-химическому свойству. Нормальное содержание белка в сыворотке крови 65-80 г/л, у детей до 6 месяцев 48-56 г/л.

Изменение содержания белка в сыворотке крови может свидетельствовать о различных нарушениях. Снижение содержания белка (гипопротеинемия) может наблюдаться при потерях белка (кровотечения, болезни почек), при белковом голодании или при снижении процессов биосинтеза белка в результате различных заболеваний (интоксикации, злокачественных новообразований, хронических заболеваний). Повышенное содержание белка (гиперпротеинемия) бывает редко, это может быть при сгущении крови из-за значительной потери жидкости (длительная рвота, ожоговая болезнь, диарея), при наследственных заболеваниях - парапротеинемиях.

Одним из методов количественного определения суммарного белка сыворотки крови является биуретовый метод, который основан на способности белков, содержащих пептидные связи, образовывать с ионами меди в щелочной среде комплексные соединения фиолетового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка в растворе.

Техника выполнения работы. В пробирку налить 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную) – 0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. В обе пробирки добавить по 5,0 мл биуретового реактива (ионы Сu++ в щелочной среде). Содержимое обеих пробирок перемешать. Через 30 мин. измерить экстинкцию исследуемого раствора на ФЭКе в кювете толщиной 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора.

Содержание белка в сыворотке крови (в г/л) найти по калибровочному графику, который построен с заранее известными концентрациями стандартного белка и выражает зависимость между количеством белка в крови и оптической плотностью (экстинкцией) окрашенного раствора.

Построение калибровочного графика.

Для этого применяют стандартный белок – альбумин сыворотки крови. Из 10% стандартного раствора альбумина в 4 пробирках готовят растворы белка как показано в таблице.

Из каждой пробирки берут по 0,1 мл раствора, добавляют к нему 5,0 мл биуретового реактива. Через 30 мин. измеряют экстинкцию на ФЭКе против контрольного раствора (0,1 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 5 мл биуретового реактива).

Полученные значения откладывают на оси ординат, а концентрацию белка (в г/л) на оси абсцисс.

7.4. Контроль освоения темы занятия - решение типовой задачи:

Задача. Одним из наиболее распростаненных трипептидов животных, растительных и бактериальных клеток является глутатион. Функции глутатиона ( глу-цис-гли) разнообразны: участвует в транспорте аминокислот, инактивации инсулина, является источником ά-аминоазота в головном мозге. предохраняет ряд белков со свободными тиольными группами от окисления. Объясните участие глутатиона в окислительновосстановительных процессах, учитывая его строение.

Место проведения самоподготовки: учебная комната для самостоятельной работы студентов

Примерные темы реферативных сообщений по УИРС:

1.Основные методы исследования первичной структуры белков.

2.Шапероны и их роль в пространственной укладке синтезированной полипептидной цепи, характеристика химических связей, стабилизирующих третичную и четвертичную структуры белка.

Задание на дом. «Физико-химические свойства белков. Методы выделения и очистки белков».

Литература: Основная:

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – М.:

Медицина, 2004, 2005.

Биологическая химия: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / [Ю.Б. Филиппович, Н.И. Ковалевская, Г.А. Севастьянова и др.]; под ред. Н.И. Ковалевской. – М.: Издательский центр «Академия», 2009.

Биохимия: Учебник.//Под ред. Е.С.Северина.-М.:ГЭОТАР-МЕД, 2006,

2008.

Дополнительная:

Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ВШ, 2004.

Тюкавкина Н.А., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия. – М.Медицина,

1991.

Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии: В 3-х т. Пер. с

англ. – М.:Мир,1981.

Элиот В., Элиот Д. Биохимия и молекулярная биология. – М.: Изд-во НИИ Биомед. химии РАМН, 1999, 2001.

Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия.(пер. с немецкого).- М.: Мир,

2004.

Кнорре Д.Г. ,Мызина С.Д. Биологическая химия. М. ,2000.

Интернет сайты:

1. Электронный ресурс: http://en.wikipedia.org/.

2.Электронный ресурс: http://revjlution.allbest.ru/

3.Электронный ресурс: http://www.eridition.ru/

4.Электронный ресурс: http://fk.kture.kharkov.ua/

5.Электронный ресурс: http:// revjlution.allbest.ru/

6.Электронный ресурс: http://www.5ballov.ru/

7.Электронный ресурс: http:// www.eridition.ru/

8.Электронный ресурс: http://www.bulanoff.ru/

9.Электронный ресурс: http://www.ruzcircus.ru/

10.Электронный ресурс: http://www.ncbi.nlm.nih.gov 11.Электронный ресурс: http:// pubs.rsc.org/ 12.Электронный ресурс: http:// www.medscape.com 13.Электронный ресурс:

http://www.btec.cmu.edu/reFramed/main/mainPage.html 14.Электронный ресурс: http:// www.la-press.com

15.Электронный ресурс: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme 16.Электронный ресурс: http://www.nanometer.ru

Лабораторное занятие № 2.

Тема и ее актуальность «Простые и сложные белки. Гликопротеины, нуклеопротеины, хромопротеины»/ 2. Цель занятия. Ознакомиться и закрепить у студентов знания о структуре и

биологической роли сложных белков нуклео-, глико-, хромопротеинов. В результате освоения темы студент должен уметь:

-представить схематически первичную и вторичную структуры РНК и ДНК; -схематически представит структуру гема, охарактеризовать связи гема и глобина; Для формирования умений студент должен знать:

-строение отдельных представителей сложных белков - глико-, хромо-, нуклеопротеинов; -биологическую роль гликопротеинов сыворотки крови и слизистых оболочек;

-структуру и биологические функции ДНК и РНК; -основные формы и производные гемоглобина;

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы:

1.Изучите структуру гликопротеинов, особенности связи белкового и углеводного компонентов, примеры гликопротеинов, обладающих ферментативными, защитными, транспортными свойствами, являющихся гормонами.

2.Классификация, структура, характер связи белкового и углеводного компонентов гликозаминогликанов; физико-химические свойства протеогликановых комплексов.

3.Биологическая роль хондроитинсульфатов, гепарина; строение дисахаридных единиц, из которых построены их молекулы.

4.Гликозаминогликаны, не содержащие серную кислоту; структура дисахаридных звеньев гиалуроновой кислоты; биологическая роль и значение системы гиалуроновая кислота-гиалуронидаза.

5.Первичная структура нуклеопротеинов (нуклеиновых кислот) и отличительные особенности ДНК и РНК.

6. Вторичная структура нуклеиновых кислот, способы укладки ДНК в хромосоме ( третичная структура ДНК).

7.Вторичная и третичная структуры РНК.

8.Строение транспортной РНК и ее биологическую роль.

9.Хромопротеины, структура гемоглобина.

9. Производные гемоглобина окси-, карбокси-, карбгемоглобин, метгемоглообин; первая помощь при отравлении CO.

4. Вид занятия: лабораторное занятие

5. Продолжительность: 3 часа.

6. Оснащение: таблицы, плакаты, лабораторная посуда, набор реактивов, микроскоп.

7. Содержание занятия.

7.1 Контроль исходного уровня знаний и умений ( тесты).

Задание 1. Выберите наиболее правильный ответ.

Гемоглобин связывается с углекислым газом …..

а) через гем б) с железом гемоглобина

в) по типу карбаминовой связи через аминогруппы остатков аминокислот

г) сложно-эфирной связью д) гликозидной связью

Задание 2. Установите соответствие цифровых и буквенных

Задание 3. Подберите сочетание правильных ответов. Протеогликановые комплексы (мукополисахариды)

характеризуются … .

1.внеклеточной локализацией

2.цементирующей ролью кератансульфата

3.цементирующей ролью гиалуроновой кислоты

4.суперперевитой -спиралью

5.только внутриклеточной локализацией

Задание 4. Определите правильность утверждений в предложении и наличие логической связи между ними.

тРНК участвует в синтезе белка, потому что она транспортирует иРНК.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия. - О- и N-гликозидные связи между белковым и углеводными компонентами гликопротеинов;

-гликопротеины слизей: муцина слюны, гастро-, урогликопротеинов;

-классификация гликозаминогликанов;

-строение дисахаридных звеньев гиалуроновой кислоты, хондроэтин-, кератан-, дерматан-, гепарансульфата;

-роль гиалуроновой кислоты как цементирующего агента межклеточного матрикса;

-двойная спираль ДНК и ее характеристики:- диаметр, количество нуклеотидных пар в витке.

-пространственная укладка молекулы ДНК в хромосомах;

-роль гистонов в ДНК-протеинах;

-вторичная и третичная структуры РНК;

-строение транспортной РНК, ее био-логическая роль;

-химическая формулу гема;

-соединение молекулы гема с полипептидными цепями глобина в молекуле гемоглобина;

-четвертичная структура гемоглобина;

-производные гемоглобина: окси-, карбокси-, карбгемоглобин;

-первая помощь при отравлении CO;

-строение метгемоглобина, соединения и лекарственные вещества, приводящие к метгемоглобинемии.

7.3.Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя (лабораторная работа, оформление результатов проведенных лабораторных работ).

Реактивы: концентрированная уксусная кислота, NaCl, 1% спиртового раствора тимола, концентрированная серная кислота.

Работа № 1. Проба Тейхмана.

Проба позволяет обнаружить наличие очень небольших количеств крови в исследуемом материале. Широко используется в судебномедицинской практике.

Проба основана на том, что при действии на гемоглобин концентрированных кислот происходит отщепление свободного гема, который в присутствии солей соляной кислоты переходит в гемин, выпадающий в форме характерных кристаллов ромбовидной формы.

Ход работы. Приготовить мазок крови и осторожно подсушить его, держа стекло высоко над пламенем спиртовки. Прибавить 2-3 кристаллика NaCl и 1-2 капли концентрированной уксусной кислоты, тщательно перемешать стеклянной палочкой и нагреть до кипения на небольшом пламени.

После охлаждения стекла исследовать мазок под микроскопом. Кристаллы гемина зарисовать в протоколе.

Рисунок 4. Кристаллы гемина под микроскопом.

Работа № 2. Выделение муцина слюны и определение в нем углеводного компонента.

Углевод в муцине можно обнаружить с помощью реакции Молиша. Реакция основана на дегидратации гексоз и пентоз с образованием оксиметилфурфурола и фурфурола при действии концентрированной серной кислоты, которые дают с тимолом продукт конденсации красного цвета.