бх методическое указание

11.Электронный ресурс: http:// pubs.rsc.org/ 12.Электронный ресурс: http:// www.medscape.com 13.Электронный ресурс:

http://www.btec.cmu.edu/reFramed/main/mainPage.html 14.Электронный ресурс: http:// www.la-press.com

15.Электронный ресурс: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme 16.Электронный ресурс: http://www.nanometer.ru

Лабораторное занятие № 6. 1.Тема и ее актуальность. «Общие свойства ферментов».

Знание строения и свойств ферментов необходимы для понимания всех биохимических процессов, протекающих в живых организмах, для понимания регуляции обмена, изменений биохимического статуса при патологических состояниях и воздействия лекарственных веществ.

2. Цель занятия. Углубить и закрепить знания студентов о структуре и функциях энзимов, сопоставить в эксперименте свойства ферментов и неорганических катализаторов, на примере амилазы слюны экспериментально изучить специфичность действия ферментов, влияние на их активность таких факторов, как температура и рН среды.

В результате освоения темы студент должен уметь:

-схематически изображать комплементарность взаимодействия активного центра энзима и субстрата; -представить график зависимости активность ферментов от рН среды и температуры;

-использовать знания общих свойств ферментов для решения ситуационных задач.

Для формирования умений студент должен знать:

-строение молекулы фермента, предназначение активного, аллостерического центров; -особенности структуры ферментов-протеинов и ферментов-протеидов;

-химическую природу кофакторов, коферментов; -механизм ферментативного катализа; -классификацию и номенклатуру ферментов.

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы:

1.Понятие «фермент». Функции и химическая природа ферментов.

2.Принципы номенклатуры и классификации ферментов. 3. Выпишите

ввиде таблицы все классы и подклассы ферментов.

3.Строение ферментов. Простые и сложные ферменты. Разберите понятия: кофермент, апофермент, холофермент, активный центр, аллостерический центр.

4.Свойства ферментов, черты сходства и различия ферментов и неорганических катализаторов:

5.Понятие о специфичности фермента, биологический смысл специфичности, виды специфичности.

6.Теории энзим-субстратных взаимодействий Фишера и Кошленда (определение), какая из этих теорий приемлема на современном уровне для объяснения специфичности ферментов.

7.Зависимость активности термолабильных ферментов от температуры, примеры термолабильных и термостабильных ферментов, практическое значение, график зависимости.

8.Зависимость от рН среды активности пепсина, трипсина, амилазы слюны, кислой и щелочной фосфатазы, графическое изображение.

9.Охарактеризовать зависимость скорости ферментативной реакции от

концентрации фермента. Привести график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.

10. Классификация коферментов, характер связи между различными коферментами и апоферментами.

4. Вид занятия: лабораторное занятие

5. Продолжительность: 2 часа.

6. Оснащение: таблицы, плакаты, лабораторная посуда, термостат, фотоэлектроколориметр.

7. Структура занятия.

7.1 Контроль исходного уровня знаний и умений ( тесты).

Задание 1. Выберите один наиболее верный ответ. Абсолютной специфичностью обладает:

а) протеиназа б) липаза в) уреаза

г) α-амилаза

Задание 2. Установите соответствие.

Определите номер каждого класса ферментов согласно

Задание 3. Выберите сочетание ответов.

Фермент от неорганического катализатора отличает ....

1)способность ускорять реакцию

2)высокая специфичность

3)выход из реакции в неизменном состоянии

4)термолабильность

5)действие в малых концентрациях

Задание 4. Определите правильность утверждений в предложении и установите наличие причинной связи между ними.

Na+ , K+- АТФ-аза относится к классу ферментов трансфераз, потому что Na+, K+-АТФ-аза осуществляет перенос ионов Na и К.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.

-сопоставление свойств ферментов и неорганических катализаторов; -основные положения ферментативного катализа; -ферменты-протеины и ферменты-протеиды;

-понятия - кофермент, апофермент, холофермент, активный центр, аллостерический центр; -строение активных центров ферментов простых и сложных белков;

-ферментативная активностью молекул других классов биополимеров;

-строение активного центра холинэстеразы;

-функциональные группы (и поставляющие их аминокислоты), чаще всего участвующие в формировании активного центра ферментов;

-механизм действия холинэстеразы;

-термолабильные и термостабильные ферменты,практическое значение зависимости активности ферментов от температуры;

-зависимость от рН среды активности ряда ферментов: пепсина, трипсина, амилазы слюны, кислой и щелочной фосфатазы;

-классификация ферментов, классы подклассы ферментов;

-примеры типов реакций, катализируемых каждым из 6 классов ферментов.

7.3.Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя (лабораторная работа, оформление результатов проведенных лабораторных работ).

Реактивы: MnO2, 1% раствора Н2О2. разведенная кровь, 1% раствора крахмала, 1% раствора сахарозы, раствора Люголя, 10% раствора NaOH, 0,2 м раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия , 0,1 м раствор лимонной кислоты

Работа № 1. Сравнение действия ферментов и минеральных катализаторов: разложение перекиси водорода неорганическим катализатором и ферментом.

Данная работа доказывает тезис о гораздо большей эффективности белковых катализаторов по сравнению с неорганическими катализаторами. Разложение перекиси водорода может произойти под влиянием MnO2 или специфического фермента каталазы, содержащегося в эритроцитах крови. В обоих случаях выделяется молекулярный кислород, но в случае каталазы перекись разлагается гораздо быстрее (бурное выделение пузырьков О2) и с меньшей концентрации катализтора.

MnO2

2 H2O2 O2 + 2H2O

каталаза Ход работы. Налить в 2 пробирки по 2-3 мл 1% раствора Н2О2. В одну

пробирку прибавить небольшое количество порошка MnO2, во вторую - 1-2 мл гемолизированной разведенной крови ( в соотношении 1:1000). Обе пробирки встряхнуть и отметить выделение пузырьков молекулярного кислорода.

Результат. Вывод.

Работа № 2. Специфичность ферментов.

В две пронумерованные пробирки приливают по 5 капель разведенной слюны. В 1 пробирку добавляют 10 капель 1% раствора крахмала, во 2- 10 капель 1% раствора сахарозы. Обе пробирки помещают на 10 минут в термостат или водную баню при температуре 38оС, после чего содержимое пробирок делят на 2 части, с одной проделывают реакцию на крахмал, с другой реакцию Троммера.

Качественная реакция на крахмал

К исследуемой жидкости добавить 1-2 капли раствора Люголя. При наличии крахмала отметьте появление темно-синего окрашивания.

Реакция Троммера

К 5 каплям исследуемой жидкости прибавляют 5 капель 10% раствора NaOH и 5 капель раствора CuSO4 и нагревают. В присутствии глюкозы и мальтозы выпадает желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди. Полученный результат занести в таблицу.

Сделайте вывод о субстратной специфичности фермента.

Работа № 3. Термолабильность ферментов.

Большинство ферментов термолабильны - при нагревании до 60-80о утрачивают каталитическую активность. Степень инактивирования зависит от длительности теплового воздействия. При низких температурах ферменты хорошо сохраняются, но скорость ферментативного катализа снижается. В термолабильности ферментов можно убедиться на примере действия ферментов слюны: амилазы и мальтазы.

Порядок выполнения работы

В чистую пробирку отливают небольшое количество разведенной слюны (2-3мл) и кипятят ее в течение 5-8 минут, после чего охлаждают В 3 пронумерованные пробирки наливают по 10 капель 1% раствора крахмала. В 1 пробирку добавляют 10 капель слюны, разведенной в 5 раз, во 2-ю 10 капель прокипяченной слюны, в 3-ю 10 капель воды (качестве контроля). Все пробирки помещают в термостат или водяную баню при температуре 38она 10 минут. После этого проделывают качественные реакции на крахмал и реакцию Троммера на продукты расщепления.

Реакция на крахмал. К 5 каплям исследуемого раствора приливают 1 каплю раствора йода в йодистом калии. В присутствии крахмала появляется синее окрашивание. Полученный результат занести в таблицу.

1.

2.

3.

Работа № 4. Влияние реакции среды (оптимум рН) на действие ферментов слюны.

Для проявления максимальной каталитической активности ферментов требуются определенные условия, в том числе оптимальная концентрация водородных ионов. Каждый фермент наиболее активен в пределах довольно узкой зоны рН, называемой оптимум рН. Активность ферментов уменьшается, если рН меняется в любую сторону от оптимального значения. Отклонение рН от оптимума влияет на степень ионизации фермента и субстрата, может нарушить связь между белковой частью фермента и их простетическими группами, может влиять на связывание субстрата с ферментами.

Оптимальное значение рН для некоторых ферментов

Порядок выполнения работ

В 7 предварительно пронумерованных пробирок наливают 0,2 м раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,1 м раствор лимонной кислоты в соотношениях, указанных в таблице. Получают буферные растворы с рН от 5,6 до 8,0. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 1% раствора крахмала, по 10 капель слюны, разведенной в 100 раз. Перемешивают содержимое пробирок и помещают их в водяную баню или термостат при температуре 38о на 5-10 минут (в зависимости от индивидуальных особенностей активности слюны).

Влияние рН среды на активность амилазы

Затем во все пробирки добавляют по 1 капле раствора йода в йодистом калии, перемешивают, наблюдают окраску и определяют рН, при котором амилаза действует наиболее активно. В зависимости от активности слюны ее можно разводить не в 100, а в 50 или 10 раз.

7.4. Контроль освоения темы занятия - решение типовой задачи:

Задача. Экспериментальные данные свидетельствуют, что в некоторых случаях при полном насыщении фермента субстратом тепловая денатурация фермента наступает при более высоких температурах. Чем это объясняется? Место проведения самоподготовки: учебная комната для самостоятельной работы студентов

Примерные темы реферативных сообщений по УИРС:

1.Рибозимы – биологические катализаторы небелковой природы.

2.Кофакторы ферментов класса трансфераз.

Задание на дом. «Кинетика ферментативных реакций. Регуляция активности ферментов».

Литература: Основная:

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – М.:

Медицина, 2004, 2005.

Биологическая химия: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / [Ю.Б. Филиппович, Н.И. Ковалевская, Г.А. Севастьянова и др.]; под ред. Н.И. Ковалевской. – М.: Издательский центр «Академия», 2009.

Биохимия: Учебник.//Под ред. Е.С.Северина.-М.:ГЭОТАР-МЕД, 2006,

2008.

Дополнительная:

Байгильдина А.А., Терегулова Т.Г., Камилов Ф.Х. Номенклатура и классификация ферментов: Уч.- метод. пособие. - Уфа, 2005.

Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ВШ, 2004.

Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии: В 3-х т. Пер. с

англ. – М.:Мир,1981.

Элиот В., Элиот Д. Биохимия и молекулярная биология. – М.: Изд-во НИИ Биомед. химии РАМН, 1999, 2001.

Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия.(пер. с немецкого).- М.: Мир,

2004.

Кнорре Д.Г. ,Мызина С.Д. Биологическая химия. М. ,2000.

Интернет сайты:

1.Электронный ресурс: http://en.wikipedia.org/.

2.Электронный ресурс: http://revjlution.allbest.ru/

3.Электронный ресурс: http://www.eridition.ru/

4.Электронный ресурс: http://fk.kture.kharkov.ua/

5.Электронный ресурс: http:// revjlution.allbest.ru/

6.Электронный ресурс: http://www.5ballov.ru/

7.Электронный ресурс: http:// www.eridition.ru/

8.Электронный ресурс: http://www.bulanoff.ru/

9.Электронный ресурс: http://www.ruzcircus.ru/

10.Электронный ресурс: http://www.ncbi.nlm.nih.gov 11.Электронный ресурс: http:// pubs.rsc.org/ 12.Электронный ресурс: http:// www.medscape.com 13.Электронный ресурс: http://www.btec.cmu.edu/reFramed/main/mainPage.html 14.Электронный ресурс: http:// www.la-press.com

15.Электронный ресурс: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme 16.Электронный ресурс: http://www.nanometer.ru

Лабораторное занятие № 7.

1.Тема «Кинетика ферментативных реакций. Регуляция активности ферментов».

2. Цель занятия. В результате освоения темы занятия студент освоить основные положения ферментативной кинетики, механизмы активирования и ингибирования ферментов, лежащие в основе регуляции обмена веществ и действия многих лекарств.

В результате освоения темы студент должен уметь: -объяснить механизм активирования и ингибирования;

-графически изображать изменения кинетических характеристик фермента в присутствии различных видов активаторов и ингибиторов; -решать ситуационные задачи по ферментативной кинетике.

Для формирования умений студент должен знать:

-основные положения кинетики ферментативных реакций, зависимость скорости ферментативной реакции от [S], [E], t, pH;

-механизмы активирования ферментов; -классификацию и механизм действия различных классов ингибиторов.

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы:

1.Константа Михаэлиса, ее вывод, физический смысл.

2.Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата, уравнение Михаэлиса-Ментен; график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента по Михаэлису-Ментен; анализ уравнения.

3.Преобразование уравнение Михаэлиса-Ментен в уравнение Лайнуивера-Берка и его графическое выражение, использование данной зависимости для анализа действия специфических обратимых ингибиторов.

4.Энергия активации. Графическое объяснение катализа с термодинамических позиций.

5.Строение активного центра ацетилхолинэстеразы, механизм ее действия.

4. Вид занятия: лабораторное занятие

5. Продолжительность: 4 часа.

6. Оснащение таблицы, плакаты, реактивы, лабораторная посуда, термостат, фотоэлектроколориметр.

7. Структура занятия.

7.1Контроль исходного уровня знаний и умений ( тесты).

Задание 1. Выберите один наиболее верный ответ.

Гексокиназа катализирует реакцию фосфорилирования гексоз. Кm гексокиназы для аллозы составляет 8 10-3 моль/л, а для маннозы – 5 10-6 моль/л. Какой из субстратов будет фосфорилироваться с наибольшей скоростью, если их концентрация в среде инкубации одинакова и составляет 8 10-7 моль/л?

а) аллоза б) манноза

в) скорость превращения обоих субстратов будет одинакова