бх методическое указание

г) имеющиеся данные не позволяют ответить на поставленный вопрос

Задание 3. Выберите несколько правильных ответов.

Лекарственные вещества-антиметаболиты являются конкурентными ингибторами, если … .

1.необратимо связываются с ферментом

2.обратимо связываются с ферментом

3.нет зависимости между степенью ингибирования и концентрацией субстрата

4.прочно соединяются с простетической группой фермента

5.вызывают денатурацию фермента

Задание 4. Определите правильность утверждений в предложении и установите наличие причинной связи между ними.

Константа Михаэлиса является основной характеристикой ферментативной реакции, потому что она характеризует сродство фермента к субстрату.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.

-вывод константы Михаэлиса;

-зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата:

-уравнение Михаэлиса-Ментен, анализ уравнения;

-график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата;

-уравнение Лайнуивера-Берка и его графическое выражение;

-зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента;

-классификация типов ингибирования ферментов, примеры, механизм их действия;

-графики Лайнуивера-Берка для конкурентного и неконкурентного ингибирования;

-понятие «аллостерический центр», особенность кинетики аллостерических ферментов;

- примеры использования различных типов ингибиторов ферментов в качестве лекарственных средств; - основные типы активировании ферментов,механизмы активирующего

действия ионов металлов, анионов, ограниченный протеолиз, аллостерическая активация ферментов, активация путем ассоциации, диссоциации субъединиц, ковалентной модификации (фосфорилированиядефосфорилирования).

7.3. Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя (лабораторная работа, оформление результатов проведенных лабораторных работ).

Реактивы: 1% раствора NaCl, 1% раствора CuSО4, 10% раствора NaOH, 1% раствора малоновой кислоты, 1% раствора метиленовой сини, 1% раствора янтарной кислоты, вазелиновое масло.

Работа № 1. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы ротовой жидкости.

Целью данной работы является установление актвирующего и ингибирующего влияния различных ионов на каталитическую активность ферментов. Так, например, ионы натрия и хлора стимулируют активность амилазы слюны, а ионы меди, наоборот, тормозят ее.

Ход работы. Споласкивают рот, в чистую пробирку собирают 3мл слюны и разводят ее в 10 раз ( добавить 27 мл дистиллированной воды). В три пробирки налить по 10 мл разведенной в 10 раз слюны. В первую пробирку добавить 1 мл 1% раствора NaCl, во вторую-1 мл 1% раствора CuSО4, в третью- 1 мл дистиллированной воды (контроль). После этого в каждую пробирку прилить по 4 мл 0,5% раствора крахмала, пробирки встряхнуть и поместить в водяную баню или в термостат с температурой 380С на 10 мин. После истечения указанного времени с содержимым каждой пробирки проделать качественную реакцию на крахмал и пробу Троммера: к 5 каплям исследуемой жидкости прибавить 5 капель 10% раствора NaOH и 5 капель раствора CuSO4 и нагреть.

Полученные результаты занесите в таблицу, определите тип активирования и тип ингибирования.

Работа № 2. Конкурентное торможение сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой.

Принцип метода основан на изменении окраски метиленовой сини при восстановлении его в ходе окислительно-восстановительной реакции. При дегидрировании янтарной кислоты сукцинатдегидрогеназой акцептором водорода является метиленовая синь, которая при восстановлении

обесцвечивается. Чем быстрее обесцвечивается метиленовая синь, тем выше активность сукцинатдегидрогеназы. Ингибирование фермента замедляет скорость обесцвечивания метиленовой сини.

Ход работы. В три пронумерованные пробирки поместить 3-4 капли мышечной кашицы и добавить: в первую – 0,8 мл воды, во вторую- 0,2 мл 1% раствора малоновой кислоты и 0,6 мл воды, в третью – 0,8 мл 1% раствора малоновой кислоты. Во все три пробирки добавляют по 1 мл 1% раствора янтарной кислоты и по 1 капле 1% раствора метиленовой сини. После перемешивания добавляют по 3 капли вазелинового масла. Пробирки ставят в водяную баню, нагретую до 370С. Через 5 мин наблюдают изменение окраски раствора. Сравните степень уменьшения голубого окрашивания в 3-х пробирках и сделать вывод о механизме действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы.

Отметьте результат и сделайте вывод.

7.4. Контроль освоения темы занятия - решение типовой задачи:

Задача. Фермент (10мкг) с молекулярной массой 500.000 г/моль превращает 9,6 мкмоль субстрата в минуту при температуре 25С. Подсчитайте число оборотов.

Место проведения самоподготовки: учебная комната для самостоятельной работы студентов

Примерные темы реферативных сообщений по УИРС:

1.Общие методы определения активности ферментов.

2.Регуляция активности ферментов.

Задание на дом. «Методы количественного определения ферментов. Изоферменты. Основные направления медицинской энзимологии».

Литература: Основная:

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – М.:

Медицина, 2004, 2005.

Биологическая химия: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / [Ю.Б. Филиппович, Н.И. Ковалевская, Г.А. Севастьянова и др.]; под ред. Н.И. Ковалевской. – М.: Издательский центр «Академия», 2009.

Биохимия: Учебник.//Под ред. Е.С.Северина.-М.:ГЭОТАР-МЕД, 2006,

2008.

Дополнительная:

Байгильдина А.А., Терегулова Т.Г., Камилов Ф.Х. Номенклатура и классификация ферментов: Уч.- метод. пособие. - Уфа, 2005.

Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ВШ, 2004.

Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии: В 3-х т. Пер. с

англ. – М.:Мир,1981.

Элиот В., Элиот Д. Биохимия и молекулярная биология. – М.: Изд-во

НИИ Биомед. химии РАМН, 1999, 2001.

Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия.(пер. с немецкого).- М.: Мир,

2004.

Кнорре Д.Г. ,Мызина С.Д. Биологическая химия. М. ,2000.

Интернет сайты:

1.Электронный ресурс: http://en.wikipedia.org/.

2.Электронный ресурс: http://revjlution.allbest.ru/

3.Электронный ресурс: http://www.eridition.ru/

4.Электронный ресурс: http://fk.kture.kharkov.ua/

5.Электронный ресурс: http:// revjlution.allbest.ru/

6.Электронный ресурс: http://www.5ballov.ru/

7.Электронный ресурс: http:// www.eridition.ru/

8.Электронный ресурс: http://www.bulanoff.ru/

9.Электронный ресурс: http://www.ruzcircus.ru/

10.Электронный ресурс: http://www.ncbi.nlm.nih.gov 11.Электронный ресурс: http:// pubs.rsc.org/ 12.Электронный ресурс: http:// www.medscape.com 13.Электронный ресурс: http://www.btec.cmu.edu/reFramed/main/mainPage.html 14.Электронный ресурс: http:// www.la-press.com

15.Электронный ресурс: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme 16.Электронный ресурс: http://www.nanometer.ru

2. Цель занятия. Освоить методы определения активности ферментов и единицы выражения активности ферментов, охарактеризовать значение определения активности ферментов для диагностики заболеваний.

В результате освоения темы занятия должны уметь:

-решать ситуационные задачи по энзимопатологии и энзимодиагностики; -оценить диагностическую значимость определения активности ферментов в биологических средах.

Для формирования умения студенты должны знать: -изоферменты, мультиэнзимные комплексы; -единицы измерения активности ферментов; -условия определения активности ферментов;

-основные направления медицинской энзимологии - энзимопатологию, энзимодиагностику, энзимотерапию.

3. Вопросы для самоподготовки к освоению данной темы:

-Сущность понятий «изоферменты»,и «множественные формы ферментов, мультиферментные комплексы;

-Изоферменты лактатдегидрогеназы, диагностическое значение, органоспецифичность; -Единицы абсолютной и относительной активности ферментов;

-Медицинская энзимология, ее аспекты: а)энзимопатология, примеры заболеваний, связанных с генетическими дефектами различных ферментов; б) энзимотерапия, примеры использования ферментов в качестве лекарственных средств; в) энзимодиагностика, примеры ферментов, используемых в диагностике заболеваний;

4. Вид занятия: лабораторное занятие

5. Продолжительность: 4 часа.

6. Оснащение таблицы, плакаты, реактивы, лабораторная посуда, термостат, фотоэлектроколориметр.

7. Структура занятия.

7.1 Контроль исходного уровня знаний и умений ( тесты).

Задание 1. Выберите один наиболее верный ответ.

Молярная активность (число оборотов) выражается в … .

а) моль/мг мин б) моль/сек в) кат/ г-моль г) моль/кг сек

Задание 2. Установите соответствие.

Заболевание – индикаторный фермент.

Задание 3. Выберите несколько правильных ответов.

Изоферменты лактатдегидрогеназы отличаются …

1.субъединичным составом

2.тканевой локализацией

3.электрофоретической подвижностью

4.внутриклеточной локализацией

5.катализируемой реакцией

Задание 4. Определите правильность утверждений в предложении

иустановите наличие причинной связи между ними.

4.1.Определение активности ферментов необходимо производить при полном насыщении фермента субстратом - при Кm>[S], поскольку именно в этих условиях скорость реакции будет пропорциональна концентрации фермента.

7.2. Разбор с преподавателем узловых вопросов, необходимых для освоения темы занятия.

-определение терминам «изоферменты» и «множественные формы ферментов», -примеры ферментов, имеющих изоферментный спектр; биологический смысл такого явления;

-изоферментов лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинкиназы, щелочной фосфатазы, характеристика каждого из них, диагностическое и прогностическое значение определения изоферментного спектра ферментов сыворотки крови и мочи в клиник;

-примеры мультиэнзимных комплексов;

-единицы каталитической активности фермента: катал, международная единица активности, число оборотов или молекулярная активностю, удельная активность фермента;

-энзимопатология, примеры заболеваний, связанных с генетическими дефектами различных ферментов;

-энзимотерапия, примеры использования ферментов в качестве лекарственных средств;

- энзимодиагностика, примеры ферментов, используемых в диагностике заболеваний; -«иммобилизованные ферменты», использование их в практических целях,

способы иммобилизации ферментов.

7.3. Самостоятельная работа студентов под контролем преподавателя (лабораторная работа, оформление результатов проведенных лабораторных работ).

Реактивы: 0,1% раствора крахмала,

Работа № 1. Определение активности амилазы ротовой жидкости по Вольгемуту.

Амилаза - фермент, осуществляющий гидролитическое расщепление полисахаридов до декстринов и мальтозы (химизм реакции см. занятие№6). Конечные продукты действия амилазы не дают цветной реакции с йодом. Наиболее богаты амилазой слюнные и поджелудочная железы.

Клинико-диагностическое значение имеет определение активности амилазы в крови, куда она попадает из поджелудочной железы (40%) и слюнных желез (60%). Амилазная активность крови по Вольгемуту в норме составляет 25-125 Ед/л. При остром панкреатите в первые сутки заболевания активность амилазы крови возрастает в десятки раз, а затем постепенно возвращается к норме. Амилазная активность крови увеличивается также при паротите (воспалении слюнных желез). Амилаза имеет небольшую молекулярную массу – 45 000, поэтому легко проходит почечный фильтр и попадает в мочу. В связи с меньшей инвазивностью определение амилазной активности мочи (диастазный тест) широко используется в клинике для диагностики состояния поджелудочной железы (см. УИРС).

Принцип метода. Метод основан на том, что слюну разводят в определенной последовательности, после чего приливают одно и тоже количество раствора крахмала и находят наименьшее содержание фермента, которое полностью расщепляет все количество добавленного крахмала. Затем производят перерасчет активности фермента на 1 мл слюны.

Амилазная активность слюны или амилокластичекая сила слюны выражается количеством 0,1% раствора крахмала в мл, которое может расщепляться 1 мл слюны при температуре 380 в течении 30 мин.

В норме амилазная активность слюны составляет 160-320 ед.

Ход работы. В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. Затем в первую пробирку добавляют 1 мл слюны, разведенной в 10 раз. Содержимое первой пробирки перемешивают и 1 мл раствора (суммарное разведение в 20 раз) переносят из 1-й пробирки во вторую, перемешивают( рслюна разведена в 40 раз). Затем 1 мл разведенной слюны из второй переносят в третью и.т.д. - из предыдущей пробирки в следующую. Из 10 пробирки 1 мл смеси выливают. Таким образом, получается ряд разведенной слюны, в котором в каждой последующей пробирки содержание фермента вдвое меньше, чем в предыдущей.

2,4-динитрофенилгидразон ПВК Ход определения. Сыворотку крови разводят в 3 раза

дистиллированной водой. Вносят в пробирку 0,1 мл разведенной сыворотки, 0,3 мл раствора НАД + и ставят на 5 мин в водяную баню при 370С (для прогревания смеси).

Во вторую пробирку добавляют 0,8 мл раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл раствора лактата натрия и нагревают на водяной бане при 370С.

Выливают содержимое второй пробирки в первую, быстро перемешивают стеклянной палочкой, не вынимая пробирки из бани, и отмечают время начала инкубации. Через 25 мин реакцию останавливают, прибавляя 0,5 мл раствора 2,4-ДНФГ, и оставляют пробирку на 20 мин при комнатной температуре (для образования гидразона).

К смеси приливают 5 мл раствора NaOH, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и через 10 мин (после развития окраски) измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 520-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1см. Контрольную пробу готовят как опытную, но разведенную сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику.

Оформление работы. Рассчитать активность фермента в исследуемой сыворотке крови, сделать вывод о возможных причинах изменений активности фермента.

Практическое значение работы. Определение активности лактатдегидрогеназы используется в клинико-биохимических лабораториях для диагностики и установления прогноза заболевания. В норме активность фермента составляет 0,8- 4,0 ммоль/ (ч л) и возрастает, как правило, у больных с повреждением миокарда, скелетных мышц, почек, а также при анемиях, опухолевых поражениях, остром гепатите и т.д.

7.4. Контроль освоения темы занятия - решение типовой задачи:

Задача. В приемное отделение больницы доставлен больной с подозрением на инфаркт миокарда. Определение активности каких ферментов помогут в подтверждения диагноза?

Место проведения самоподготовки: учебная комната для самостоятельной работы студентов

Примерные темы реферативных сообщений по УИРС:

1.Термостабильные ДНК-полимеразы (Taq-полимераза) и их использование в методе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и его использование в клинической и экспериментальной биохимии.

3.Изоферменты в диагностике заболеваний.

Задание на дом. «Коллоквиум. Ферменты».

Литература: Основная:

Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия: Учебник. – М.:

Медицина, 2004, 2005.

Биологическая химия: учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / [Ю.Б. Филиппович, Н.И. Ковалевская, Г.А. Севастьянова и др.]; под ред. Н.И. Ковалевской. – М.: Издательский центр «Академия», 2009.

Биохимия: Учебник.//Под ред. Е.С.Северина.-М.:ГЭОТАР-МЕД, 2006,

2008.

Дополнительная:

Байгильдина А.А., Терегулова Т.Г., Камилов Ф.Х. Номенклатура и классификация ферментов: Уч.- метод. пособие. - Уфа, 2005.

Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: ВШ, 2004.

Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии: В 3-х т. Пер. с

англ. – М.:Мир,1981.

Элиот В., Элиот Д. Биохимия и молекулярная биология. – М.: Изд-во НИИ Биомед. химии РАМН, 1999, 2001.

Кольман Я., Рем К.Г. Наглядная биохимия.(пер. с немецкого).- М.: Мир,

2004.

Кнорре Д.Г. ,Мызина С.Д. Биологическая химия. М. ,2000. Интернет сайты:

1.Электронный ресурс: http://en.wikipedia.org/.

2.Электронный ресурс: http://revjlution.allbest.ru/

3.Электронный ресурс: http://www.eridition.ru/

4.Электронный ресурс: http://fk.kture.kharkov.ua/

5.Электронный ресурс: http:// revjlution.allbest.ru/

6.Электронный ресурс: http://www.5ballov.ru/

7.Электронный ресурс: http:// www.eridition.ru/

8.Электронный ресурс: http://www.bulanoff.ru/

9.Электронный ресурс: http://www.ruzcircus.ru/

10.Электронный ресурс: http://www.ncbi.nlm.nih.gov 11.Электронный ресурс: http:// pubs.rsc.org/ 12.Электронный ресурс: http:// www.medscape.com 13.Электронный ресурс: http://www.btec.cmu.edu/reFramed/main/mainPage.html 14.Электронный ресурс: http:// www.la-press.com

15.Электронный ресурс: http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme 16.Электронный ресурс: http://www.nanometer.ru