Оплодотворение

Тема 3. ОПЛОДОТВОРЕНИЕ

Цель занятия: изучение основных этапов процесса оплодотворения на примере лошадиной аскариды.

Яйца аскариды представляют собой очень удобный объект для изучения процесса оплодотворения и ранних этапов развития благодаря крупным размерам и небольшому числу хромосом (4 в диплоидном наборе). При окрашивании железным гематоксилином это позволяет наблюдать четкие картины изменений ядерного материала в ходе мейотических делений и далее при первом делении дробления зиготы.

Встреча гамет у аскариды происходит внутри половых путей самки (внутреннее оплодотворение). Вхождение сперматозоида в яйцеклетку у аскариды (а также у птиц и некоторых млекопитающих) происходит еще до делений созревания, на стадии ооцита I порядка. После проникновения сперматозоида внутрь появляется оболочка оплодотворения, препятствующая полиспермии. При раннем проникновении в яйцеклетку материал сперматозоида пребывает в ней в состоянии покоя до тех пор, пока не завершится мейоз.

Оплодотворенные ооциты от момента проникновения сперматозоида и до первых делений дробления находятся в матке аскариды, причем более поздние стадии – ближе к переднему концу матки.

Препараты для изучения процесса оплодотворения и дробления обычно представляют собой поперечные срезы матки аскариды (за исключением препарата 7). Общую картину среза следует изучить при малом и среднем увеличении, структуру зиготы – при большом увеличении.

Препарат 6. Деления созревания яйцеклеток аскариды. Железный гематоксилин.

Препарат представляет собой поперечный срез через матку аскариды. Стенка матки выстлана колбовидными клетками фолликулярного эпителия, выступающими в ее полость, которую заполняет множество клеток округлой или овальной формы (в зависимости от прохождения среза), – ооцитов I или II порядка. Между ними находится некоторое количество безжгутиковых сперматозоидов в виде темноокрашенных клеток «атипичной» конусовидной формы. В расширенной части сперматозоида расположено небольшое компактное ядро, а вокруг него многочисленные митохондрии; в сужающейся конусовидной части находится кристаллоид, состоящий из плотного преломляющего свет белка – аскаридина, синтезируемого сперматоцитом в период роста.

Ооцит I порядка. Первое деление созревания. После попадания в яйцеклетку ядро сперматозоида быстро набухает и увеличивается в объеме. В области расположения головки сперматозоида (обычно ближе к центру зиготы) можно различить темное пятно – это та область ядра, ДНК которой еще не подверглась деконденсации; иногда в ней просматриваются 2 хромосомы. Вокруг этого участка располагается ореол уже деконденсированного материала. На периферии зиготы при удачном прохождении среза может быть видно веретено первого деления созревания в виде темного пятнышка, иногда видны хромосомы в виде двух тетрад, образованных попарно сближенными гомологами. На этом этапе созревания оболочка ооцита еще не отошла от плазматической мембраны (т.е. оболочка оплодотворения еще не сформирована), а пенистая цитоплазма содержит много относительно крупных вакуолей.

Ооцит II порядка. Второе деление созревания. На данном этапе оплодотворения деконденсация почти завершилась: темное пятно головки спермия уже не видно, а область хроматина мужского ядра большего диаметра и более плотная, чем на предыдущем препарате. На периферии по-прежнему видно веретено деления, но это уже веретено второго деления созревания. Иногда в его области просматриваются 2 хромосомы. На этом этапе уже образовалось перивителлиновое пространство, и оболочка оплодотворения уже отошла от плазматической мембраны зиготы. К оболочке оплодотворения прилегает первое редукционной тельце (полоцит) в виде темного мелкого образования. Его положение указывает на то, что первое мейотическое деление у аскариды заканчивается еще до отхождения оболочки оплодотворения. Цитоплазма зиготы на этом этапе содержит многочисленные мелкие вакуоли.

Кроме того, на препарате различим тонкий темный ободок, покрывающий оболочку оплодотворения снаружи. Это третичная оболочка – кутикула, которую секретируют клетки матки после оплодотворения. Сначала она тонкая, но на поздних этапах оплодотворения становится толстой и бугристой.

Задание:

Рассмотреть при малом увеличении (х 8) поперечный срез матки аскариды и зарисовать его фрагмент (сектор примерно 1/3 – ¼ от общей площади среза).

Рис 1. Фрагмент поперечного среза матки лошадиной аскариды. Железный гематоксилин. Об. х 8.

Обозначения: 1 – колбовидные фолликулярные клетки стенки матки;

2 – яйцеклетки;

3 – сперматозоиды.

При большом увеличении (х 40) найти зиготы в состоянии первого и второго мейотических делений и зарисовать их, обратив внимание на морфологические различия.

Рис. 2. Первое деление созревания яйцеклетки лошадиной аскариды. Железный гематоксилин. Об. х 40.

Обозначения: 1 – конденсированная часть ядра сперматозоида;

2 – деконденсированная часть ядра сперматозоида;

3 – веретено первого деления созревания ядра яйцеклетки (если видно);

4 – крупные вакуоли;

5 – желточная (первичная) оболочка;

6 – цитоплазматическая мембрана.

Рис 3. Второе деление созревания яйцеклетки лошадиной аскариды. Железный гематоксилин. Об. х 40.

Обозначения: 1 – полностью деконденсированное ядро сперматозоида;

2 – веретено второго деления созревания яйцеклетки (если видно);

3 – первое редукционное тельце;

4 – мелкие вакуоли;

5 – цитоплазматическая мембрана;

6 – перивителлиновое пространство;

7 – оболочка оплодотворения (желточная);

8 – кутикулярная оболочка.

Примечание: Первое деление созревания (реже второе) можно также наблюдать на препарате 7. Оплодотворение у лошадиной аскариды. Отличия от предыдущего препарата заключаются в другой окраске (гематоксилином-эозином), а также в том, что на нем яйцеклетки и сперматозоиды лежат свободно (вне матки) и в небольших количествах. Однако, сохранность этих препаратов и четкость наблюдаемой картины состояния содержимого зиготы несколько хуже.

Препарат 8. Синкарион. Поперечный срез матки лошадиной аскариды. Железный гематоксилин.

Этот препарат, как и 6-й, представляет собой поперечный срез матки аскариды, но расположенный ближе к влагалищу. На нем, как правило, можно наблюдать последующие этапы процесса оплодотворения (стадию пронуклеусов, метафазу, анафазу и телофазу первого деления дробления, стадию двух бластомеров).

Стадия пронуклеусов. После завершения второго деления созревания гаплоидные родительские геномы одеваются ядерными оболочками (при формировании оболочки мужского генома используется как материал собственной кариолеммы, резорбированной на предыдущих этапах, так и ресурсы яйцеклетки). Формируются мужской и женский пронуклеусы, которые начинают сближаться, двигаясь по сложной траектории. На большом увеличении они видны как два клеточных ядра, поэтому в старых руководствах зиготу аскариды на стадии пронуклеусов называли «синкарион» (так бывает не у всех животных). Часто внутри пронуклеусов виден спирализованный ядерный материал (идет подготовка к первому делению дробления). У некоторых зигот можно видеть остатки двух редукционных телец, причем первое лежит на внутренней стороне оболочки оплодотворения, а второе – на плазматической мембране зиготы. Оболочка оплодотворения хорошо различима и покрыта толстой кутикулой.

Метафаза первого деления дробления. На срезе матки следует найти зиготу, срез которой прошел через оба полюса веретена первого деления дробления. Оболочки пронуклеусов к моменту соприкосновения разрушаются и хромосомы объединяются в единую группу. Стадия метафазы легко идентифицируется по наличию метафазной пластинки, образованной хромосомами обоих пронуклеусов, которые выстроились по экватору веретена. Всего хромосом в диплоидном наборе 4, и каждая к этому моменту состоит из двух хроматид. Центриоли и их лучистые сияния из микротрубочек располагаются на периферии зиготы друг напротив друга в виде довольно темных пятнышек расплывчатой формы, к которым сходятся отчетливо видные нити веретена деления. Состояние оболочек и редукционных телец прежнее.

Анафаза и телофаза первого деления дробления.

Анафаза, в силу кратковременности существования встречается редко. В этой фазе сестринские хромосомы расходятся к противоположным полюсам зиготы. В конце анафазы в центральной части клетки снаружи появляется борозда, которая постепенно углубляется и в телофазе делит клетку на две дочерние. Одновременно идет реконструкция дочерних ядер (деконденсируются хромосомы, образуются ядрышко и ядерная оболочка).

Стадия образования двух бластомеров. Эту стадию нужно уметь отличать от поздней телофазы. На двуклеточной стадии бластомеры полностью отделены друг от друга и часто лежат в разных оптических плоскостях, а на стадии телофазы обычно хорошо видны борозда дробления и контрактильное кольцо.

Задание:

Найти на препарате зиготу на стадии пронуклеусов и зарисовать ее при большом увеличении.

Рис. 4. Стадия пронуклеусов ( синкарион) у лошадиной аскариды. Железный гематоксилин. Об. х 40.

Обозначения: 1 –третичная кутикулярная оболочка;

2 – оболочка оплодотворения;

3 – перивителлиновое пространство;

4 – плазматическая мембрана;

5 – пронуклеусы;

6 – первое редукционное тельце (если есть);

7 – второе редукционное тельце (если есть).

При наличии достаточного времени следует найти и зарисовать метафазу, анафазу и телофазу первого деления дробления (структуры, которые необходимо обозначить, выделены в тексте курсивом).

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. По каким признакам можно отличить первое деление созревания яйцеклетки аскариды?

2. По каким признакам можно отличить второе деление созревания яйцеклетки аскариды?

3. Как выглядит стадия пронуклеусов у лошадиной аскариды?

4. Каково происхождение кутикулы у яйца аскариды? К какому типу яйцевых оболочек она относится?

4