Острая нормоволемическая гемодилюция с использованием нового гидроксиэтилированного крахмала (130/0,4) уменьшает локальное ишемическое повреждение у крыс

L. Xiong, C. Lei, Q. Wang, W. Li

Статья опубликована в журнале European Journal of Anaesthsiology 2008; 25: 581-588

Абстракт

В ходе данного исследования оценивался эффект острой нормоволемической гемодилюции с применением нового гидроксиэтилированного крахмала (130/0,4) на локальное мозговое ишемическое повреждение у крыс и определялась оптимальная степень гемодилюции у крыс.

Методы

Мужские особи Sprague - Dawley крыс были произвольно распределены по трем группам (n=10 в каждой): крахмал, физиологические раствор, контроль. Животным в группах крахмала и раствора проводилась гемодилюция до снижения уровня гематокрита до 30%. В другом исследовании мужские особи крыс были распределены по четырем группам (n=10 в каждой): HES30, HES25, HES20 и контроль. Крысам в группах HES30, HES25, HES20 проводилась гемодилюция гидроксиэтилированным крахмалом до снижения гематокрита до 30%, 25% и 20% соответственно. Через 15 минут после гемодилюции проводилась окклюзия правой средней мозговой артерии на 120 минут. Через 24 часа после реперфузии оценивались показатели неврологического дефицита и объем инфаркта.

Результаты

Гемодилюция гидроксиэтилированным крахмалом улучшает неврологический исход (р < 0,01) и уменьшает объем инфаркта (р < 0,05 по сравнению с контролем). Показатели неврологического дефицита в группах HES30 и HES25 были значительно ниже по сравнению с контрольными группами (р < 0,05), а объем инфаркта в группе HES20 был значительно больше по сравнению с HES30 и HES25 (р < 0,01).

Заключение

Исследование показывает, что острая нормоволемическая гемодилюция с использованием нового гидроксиэтилированного крахмала (130/0,4) уменьшает объем инфаркта и улучшает неврологический прогноз после локальной ишемии у крыс. Защита нервной системы была выше при дилюции гематокрита на 25-30% от исходного уровня, а ишемическая травма была выше при разведении на 20%.

Ключевые слова: ишемия мозга (brain ischaemia), крыса (rat), гемодилюция (haemodilution), hetastarch , нейропротекция (neuroprotection).

Введение

В настоящее время появляется все больше доказательств того, что защита нервной системы достигается за счет гемодилюции при использовании низкомолекулярного декстрана (1), альбумина (2, 3), желатина (4), альфа-альфа диаспирин cross - linked гемоглобина (3, 5) и гидроксиэтилированного крахмала (HES) (200/0,5) (6, 7). После гемодилюции происходит усиление кровотока вследствие увеличения сердечного выброса, что оказывает прямое влияние на снижение вязкости крови и уменьшения аггравации эритроцитов (6, 7).

Новый HES (130/0,4) ( Voluven , Fresenius AG , Bad Homburg , Германия) со средней молекулярной массой в 130 kD и углом замещения 0,4 был разработан относительно недавно. Эта специфика HES уже одобрена в некоторых странах для рутинного возмещения объема. Сообщается, что H ES 130/0,4 обладает фармакокинетическими и фармакодинамическими преимуществами, такими как уменьшение времени хранения в тканях, быстрая элиминация из плазмы и небольшое влияние на коагуляцию (8-11). До проведения данного исследование не было информации о защитном влиянии HES 130/0,4 на нервную систему.

Методы

Экспериментальный протокол был одобрен Этическим Комитетом для Экспериментов на Животных, и исследование проводилось согласно Guidelines for Animal Experimentation of the Fourth Military Medical University.

Животные для исследования были предоставлены Experimental Animal Center of the Fourth Military Medical University . В ходе исследования использовались самцы Sprague - Dawley крыс массой 300±20 гр. В первом исследовании 30 крыс были случайно распределены на 3 группы (n=10 в каждой): HES, физиологический раствор и контроль. Крысам в группе HES и раствора проводилась гемодилюция 6% HES 130/0,4 и 0,9% физ. раствором соответственно, до тех пор, пока уровень гематокрита не снижался до 30. Во втором эксперименте 40 самцов крыс были случайно распределены по четырем группам (n=10 в каждой): HES30, HES 25, HES 20, контроль. Крысам в группах HES30, HES 25, HES 20 проводилась гемодилюция 6% HES 130/0,4 до снижения уровня гематокрита до 30%, 25% и 20% соответственно, по сравнению с уровнем контрольной группы. Через 15 минут после гемодилюции всем животным проводилась окклюзия правой средней мозговой артерии на 120 минут, после чего следовал 24 часовой период реперфузии. При завершении реперфузии проводилась оценка неврологического дефицита и объема зоны инфаркта и сравнение данных показателей между группами.

Острая нормоволемическая гемодилюция (онг)

Животным не давали воды ad libitum в течение 12 часов до операции. Индукция анестезии проводилась 4% изофлураном в 96% кислороде через маску. Анестезия поддерживалась 2% изофлураном на 98% кислороде. Все животные дышали спонтанно. Проводилась катетеризация бедренной артерии. Канюлю соединяли с монитором ( Model 90602 A , Spacelabs Medical Inc ., Redmond , WA , USA ) посредством трансдуктера давления для мониторинга среднего артериального давления (САД) и частоты сердечных сокращений (ЧСС). Также катетеризировали бедренную вену для проведения инфузии. Пред гемодилюцией определяли pH артериальной крови, газовый состав крови (PaO₂, PaCO₂) с помощью OMNI Modular System ( Roche Diagnostics , Basel , Switzerland ), а также уровень гемоглобина и гематокрита. ОНГ сопровождалась кровопусканием из бедренной артерии. Кровопотеря немедленно восстанавливалась тем же объемом 6% HES 130/0,4 ( Beijing Fresenius Kabi Pharmaceutical Co., Ltd, Beijing, China ) или трехкратным объемом 0,9% физ. раствора с поддержанием стабильных показателей САД и ЧСС. Необходимый объем крови, который нужно было заменить, рассчитывался по следующей формуле:

Объем = [(МТ * 7,4)/100] * [((Ги –Гж) * 2) / (Ги + Гж)]

МТ - Масса тела

Ги - Гематокрит (изначально)

Гж - Гематокрит (желаемый)

Для завершения протокола гемодилюции, в среднем, требовалось 15 минут. Показатели САД, ЧСС, Hb (гемоглобин), Hct (гематокрит) и газовый состав крови вновь оценивались при завершении гемодилюции.

Локальная ишемия головного мозга

После гемодилюции состояние крыс стабилизировалось на 15 минут, а затем проводилась ишемическая атака. Всех крыс вновь вводили в наркоз 4% изофлураном. Все животные дышали спонтанно, а анестезия поддерживалась 2% изофлураном через маску. Определялась ректальная температура (Model 90651 A , Spacelabs Medical Inc.), которая поддерживалась на уровне 37°С. Локальная ишемия мозга проводилась в зоне правой средней мозговой артерии, с использованием внутрипросветной нити (12, 13). Через разрез в области шеи осуществлялся доступ к правой общей сонной артерии и правой наружной сонной артерия, которые перевязывались проксимально. Через данный разрез во внутреннюю сонную артерию вводилась нейлоновая нить 3-0 и размещалась в наружной сонной артерии на 17- 18 мм дистальнее бифуркации общей сонной артерии до момента ощущения умеренного сопротивления, при котором происходит окклюзия средней мозговой и задней соединительной артерий. После того, как нить устанавливалась на необходимой позиции, разрез на коже ушивали. Через 120 минут проводилась реперфузия, а нить аккуратно удалялась. Места разрезов обрабатывались 0,25% бупивакаин гидрохлоридом.

Восстановление и неврологическая оценка

После удаления швов и пробуждения от наркоза крыс возвращали в их клетки со свободным доступом к воде и еде. Через 24 часа после реперфузии оценивалась неврологическая симптоматика. Как было описано выше (12, 13) для этого использовалась модифицированная шкала Longa и коллег (14): 0 – нет дефицита, 1 – невозможно полностью выпрямит левые конечности, 2 – движение по кругу в левую сторону, 3 – падение налево, 4 – отсутствие спонтанных двигательных движений со сниженным уровнем сознания, 5 – смерть.

Оценка объема зоны инфаркта

При завершении неврологической оценки крысам вводили массивные дозы кетамина и производилась декапитация. Головной мозг быстро удаляли и охлаждали в течение 10 минут. Затем вырезали 6 секций по 2 мм толщиной из венечной зоны. Материал погружали в 2% 2,3,5-трифенилтетразолиум хлорид при температуре 37С на 30 минут, а затем помещали в 10% раствор формалина для фиксации. Через 24 часа материал кусочки мозга фотографировались с помощью аппаратуры Kodak , подключенной к компьютеру. Чистые (незапятнанные) зоны являлись зонами инфаркта. Объем инфаркта определялся по формуле:

Объем инфаркта = объем левого полушария – (объем правого полушария – определенный объем инфаркта)

Общий объем определялся по сумме пораженных зон в шести образцах и был представлен как процент объема второго полушария (15, 16).

Статистический анализ

Физиологические параметры и объем инфаркта выражались как среднее ± SD. Повторяемый анализ вариаций (ANOVA) использовался для физиологических данных (7, 17). Объем инфаркта оценивался одним фактором ANOVA с последующим post hoc LSD test . Анализ NDS проводили с помощью теста Kruskal - Wallis с последующим U-test с коррекцией Bonferroni .

Результаты

Эксперимент 1

Значимого различия в физиологических показателях внутри или между группами до и после ОНГ не было. Исключения составляют уровни Htc и Hb в группах, где их снижение было ожидаемо. По данным таблиц 1 и 2 уровень СаО2 значительно снизился после ОНГ.

Таблица 1. Гемодинамические и гематологические параметры (эксперимент 1)

Группа	ОНГ	САД (мм рт. ст.)	ЧСС (в минуту)	Htc (%)	Hb (мг/дл)
Контроль	До После	88,4 ± 2,2 88,4 ± 2,6	280 ± 6 275 ± 6	45,6 ± 0,4 45,5 ± 0,4	15,2 ± 0,1 15,2 ± 0,1
HES	До После	87,6 ± 3,1 87,8 ± 3,1	283 ± 4 280 ± 4	45,5 ± 1,0 30,4 ± 0,5**	15,1 ± 0,3 10,1 ± 0,2**
Раствор	До После	88,1 ± 4,1 89,7 ± 3,4	277 ± 4 275 ± 4	44,0 ± 1,1 30,3 ± 0,9	14,9 ± 0,4 10,1 ± 0,3

** Р < 0,01

Таблица 2. Параметры газового состава крови (эксперимент 1)

Группа	ОНГ	pH	PaO2 (мм рт. ст. )	PaCO2 (мм рт. ст.)	SaO2 (%)	CaO2 (мл/дл)
Контроль	До После	7,323±0,047 7,314±0,029	295,2 ± 59,6 305,9 ± 46,4	46,7±5,2 45,6±4,2	99,4±0,3 99,3±0,4	21,1±0,4 21,1±0,5
HES	До После	7,311±0,043 7,323±0,045	282,4±42,0 291,9±44,4	42,8±5,1 42,9±5,7	99,3±0,5 99,3±0,3	21,0±1,4 14,4±1,0**
Раствор	До После	7,307±0,067 7,328±0,050	265,1±50,0 274,7±47,1	42,3±5,4 40,9±4,3	99,2±0,5 99,2±0,5	20,6±1,4 14,2±1,1**

PaO₂ – парциальное давление кислорода; PaCO₂ – парциальное давление CO₂ артериальной крови; SaO₂ – сатурация кислорода; CaO₂ подсчитанное содержание кислорода (CaO₂ = 1,34*Hb*SaO₂*0,0031*PaO₂). **P < 0,01 по сравнению с контрольной группой

Данные неврологического дефицита (NDS) и объема инфаркта представлены в таблице 3.

	NDS
Группа	0	0,5	1,0	1,5	2,0	3,0	4,0	5,0	Среднее
Контроль	0	0	0	2	6	2	0	0	2,0 (1,5 – 3,0)
HES	3	0	5	0	2	0	0	0	1,0 (0,0 – 2,0)**
Раствор	0	0	1	0	6	3	0	0	2,0 (1,0 – 3,0)

** Р < 0,01 по сравнению с контрольной группой

NDS был ниже в группе HES, по сравнению с группой раствора и группой контроля (Р=0,002 для обоих сравнений). Объем инфаркта в группе HES (20±4,0%) был значительно ниже чем в группе контроля (38,8 ± 9,6%; Р=0,000) и группе раствора (49,0±10,5%; Р=0,000). Объем зоны инфаркта в группе раствора был также выше по сравнению с контрольной группой (Р=0,011).