Новиков Д.К. Медицинская микробиология

Так как заболевание связано с действием токсина, то основным

экспресс-методом диагностики является выявление токсина, парал-

лельно ведутся традиционные методы исследования.

Проводят выявление токсина в фильтрате исследуемого материала (пленки, ткани трупа) или материала после 4-5-часового подращивания бактерий в сывороточном бульоне. С этой целью можно ста-

вить реакцию коагглютинации со стафилококковым антительным противодифтерийным диагностикумом.

С этой же целью можно ставить РПГА, ИФА и ПЦР и ДНКзонды для обнаружения гена tox в бактериальной хромосоме. Используют также заражение куриных эмбрионов, наблюдают их гибель при наличии токсина. При заражении культур клеток Vero дифтерийный токсин дает ЦПД (цитопатическое действие). В реакции нейтрализации идентифицируют вид токсина.

Бактериоскопический метод. В мазке из слизи зева и фибринозного налета при окраске по Нейссеру выявляют типичную морфологию возбудителя и явление метахромазии. Можно окрашивать препарат корифосфином и изучать препарат в люминесцентном микроскопе (оранжево-красное свечение).

В остром периоде заболевания за счет антагонистических свойств возбудителя коринебактерии видны прямо в мазке при микроскопии практически в чистой культуре.

Бактериологический метод – засевают материал на сывороточный агар и другие селективные среды (Клауберга, Тинсдаля и кровяной агар, т.к. некоторые штаммы дифтерийного возбудителя не растут при наличии теллура). Идентифицируют возбудителя по культуральным, морфологическим, биохимическим свойствам и токсигенности, которую определяют методом иммунопреципитации. Для этого на чашку с сывороточным агаром накладывают фильтровальную бумагу, смоченную антитоксической противодифтерийной сывороткой, а вокруг на расстоянии 1,5 см сеют выделенные и идентифицированные дифтерийные культуры. Если культура выделяет экзотоксин, то он диффундирует в среду, и на месте встречи с антителами видны линии преципитации.

При идентификации культуры в бактериологическом методе необходима дифференциация возбудителя дифтерии от других коринебактерий, которые могут вызывать дифтериеподобные заболевания или просто находиться в слизи зева.

С.ulcerans – бактерии палочковидной формы, располагаются беспорядочно, имеют одно зерно волютина на конце; глюкозу и крахмал разлагают до кислоты, сахарозу не разлагают, выделяют уреазу, желатиназу, иногда цистиназу, не восстанавливают нитраты в нитриты, непостоянно могут выделять экзотоксин.

251

C.xerosis располагаются параллельными рядами, не имеют зерен волютина, разлагают глюкозу и сахарозу, мальтозу, восстанавливают нитраты, не разлагают крахмал и мочевину.

C.pseudodiphtericum – представитель нормальной микрофлоры. Может располагаться параллельными рядами или беспорядочно с одним зерном волютина. Не разлагает углеводы, восстанавливает нитраты в нитриты, разлагает мочевину, не имеет цистиназы, не выделяет экзотоксин.

Для установления источника инфекции необходимо проверить эпидмаркеры: фаговары (их 9), бактериоциновары (5), серовары (их 57, чаще встречается 11), биовары (4), антибиотикограмму.

Серологический метод используют при стертых формах для ретроспективной диагностики или для выявления неиммунной прослойки населения. С этой целью ставят РПГА, ИФА и реакцию нейтрализации токсина в культуре клеток Vero.

Профилактика. Неспецифическая: проводят изоляцию и лечение больных, санацию носителей антибиотиками, дезинфекцию в очаге.

Специфическая профилактика – с трех месяцев после рождения детям вводят вакцину АКДС 3 раза с интервалом в 45 дней. Ревакцинация через 1,5-2 года, вводят АКДС, или АДС-М, или АД (адсорбированный дифтерийный анатоксин) по схеме. При низком титре антител (менее 1:40 в РПГА или 0,03 мE/мл в реакции флоккуляции) по эпидемическим показаниям проводят ревакцинацию. К группам риска для вакцинации в РБ относят не только детей, но и взрослое население с низким уровнем (менее 1:40) антитоксических антител.

Лечение. Антитоксическая противодифтерийная сыворотка

применяется в ранние сроки. Ее вводят по методу Безредки (дробно, постепенно увеличивают дозу). Параллельно используют антибиотики, глюкозу, витамины, антигистаминные препараты.

14.3. Патогенные микобактерии

Туберкулез (от латинского слова tuberculum – бугорок) – хроническое инфекционное заболевание. Локализация процесса зависит от пути передачи, входных ворот и степени генерализации. Чаще встречается туберкулез легких, реже мочеполовой системы, костей, лимфоузлов. В распространении заболевания решающее значение имеют социально-бытовые условия жизни. Возбудитель открыт в 1882 г. Р. Кохом.

Туберкулез известен с глубокой древности. Туберкулезные поражения обнаружены при исследовании останков человека периода неолита (около 5000 лет до нашей эры), египетских мумий (около 2700 лет до нашей эры), мумии молодого жреца в Фивах (около 1000

252

лет до нашей эры). Такое древнее происхождение болезни связано с широким распространением микобактерий в природе среди различных животных и возможностью постоянной встречи человека с этими микроорганизмами.

Легочная форма тубекркулеза была описана еще Гипократом, Галленом, Авиценой. В древнем Китае, Индии описаны классические симптомы заболевания легких людей, которые страдали чахоткой.

В 70-80 г.г. XX века были достигнуты значительные успехи в борьбе с туберкулезом. Этому способствовали регулярное обследование населения флюорографическим методом и методом туберкулинодиагностики, обязательная вакцинация БЦЖ новорожденных, проведение химиопрофилактики людям с повышенным риском заболевания, применение сильных противотуберкулезных препаратов.

С 1991 г. отмечается рост заболеваемости туберкулезом и появлением большого числа полирезистентных микобактерий. В Республике Беларусь в 1996 г. заболеваемость составила 48,8; 1998 г. – 54,9; 199 г. – 53,6 на 100 тыс. населения. Очень напряженной является эпидобстановка в тюрьмах, где заболеваемость заключенных выше в 28 раз.

Таксономия. Семейство Mycobacteriaceae, род Mycobacterium.

По роли в патологии все представители рода микобактерий подразделяются на 4 группы:

I. Возбудители туберкулеза у человека:

M. tuberculosis (M.hominis) вызывает туберкулез у 85-90 % боль-

ных;

M. bovis (бычий тип) – у 10-15% больных; M. africanum – у 3% больных туберкулезом.

II. Возбудители микобактериозов – более 60 видов, которые выделены из организма людей, теплокровных и холоднокровных животных, страдающих заболеваниями легких, кожи, мягких тканей, лимфатических узлов. Наиболее часто встречающиеся возбудители микобактериозов – атипичные кислоустойчивые бактерии M.kansasii, M.microti, M.ulcerans и др.

III. Кислотоустойчивые сапрофиты, типичным представителем которых является M. Smegmatis, M. fortuifum и др.

IV. Возбудитель проказы – М. leprae.

Свойства возбудителей туберкулеза. Морфологические. Выра-

жен полиморфизм, встречаются палочковидные, ветвящиеся, нитевидные, фильтрующиеся L-формы. Спор, жгутиков, капсул не имеют, но есть оболочка, напоминающая микрокапсулу. Кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы, реже встречаются кислотоподатливые формы. Это связано с высоким содержанием липидов, фосфатидов и восков в клеточных стенках (до 60%), поэтому бактерии плохо воспринимают

253

анилиновые красители и обычные способы окраски. Окрашиваются по Циль-Нильсену в красный цвет, грамположительны.

Культуральные свойства. Требовательны к питательным средам и условиям культивирования. Строгие аэробы, растут медленно от 2 до 8 недель только при температуре 370С. Лучшими средами являются яичные: среда Левенштейна-Иенсена (МПА, картофельный сок, яйца, молоко, глицерин, аспарагин, малахитовая зелень для угнетения роста другой флоры); среда Финна (состав тот же, но вместо аспарагина – сложный солевой раствор). Для глубинного посева применяют цитратную кровь. Вирулентны в R-форме. На жидких средах дают рост в виде морщинистой пленки. На плотных средах образуют сухие, кремовые, бородавчатые колонии. Характер роста связан с выраженной гидрофобностью за счет большого количества липидов в клеточной стенке.

Антигенные свойства микобактерий обеспечиваются белковыми (туберкулин), полисахаридными и липидными компонентами. Они являются группоспецифическими для M. tuberculosis, M.bovis и М. leprae.

Устойчивость в окружающей среде. В высушенной мокроте сохраняются несколько недель, в воде – больше года, в почве – до 6 месяцев. Дезинфицирующие растворы разрушают микобактерий в более высокой концентрации и медленнее, чем других микроорганизмов; возбудители туберкулеза гибнут при температуре 1000С и под влиянием солнечного света.

Факторы патогенности.

Липидный корд-фактор – гликолипид, является фактором адгезии, разрушает митохондрии клеток инфицированного организма, нарушает у них функцию дыхания, тормозит миграцию полиморфноядерных лейкоцитов. При культивировании вызывает склеивание вирулентных особей в виде кос, тяжей.

Туберкулин (туберкулопротеины) обладает аллергизирующим действием, вызывает развитие ПЧЗТ.

Гликолипиды наружного слоя клеточной стенки (микозиды) и маннозные рецепторы микобактерий способствуют незавершенному фагоцитозу.

Туберкулостеариновая, фтионовая, миколевая и другие жирные кислоты оказывают токсическое действие на ткани.

Сидерофоры микобактерий конкурируют с фагоцитами за железо

– синтезируют железосодержащие ферменты и колонизируют альвеолярные макрофаги.

Характеристика заболевания

Источник инфекции – больные люди и больные животные (крупный рогатый скот), выделяющие микобактерии.

254

Пути передачи – чаще воздушно-капельный, реже контактный и алиментарный (молоко коров). Заражению способствует постоянный контакт, проживание с больным туберкулезом.

Патогенез туберкулеза. Ингалированные бактерии фагоцитируются альвеолярными легочными макрофагами и транспортируются в регионарные лимфоузлы. Фагоцитоз носит незавершенный характер. Гликолипиды-микозиды усиливают токсическое действие кордфактора, поражая мембраны митохондрий, и ингибируя фагосомолизосомальное слияние. Корд-фактор тормозит активность полиморфноядерных фагоцитов.

Увходных ворот легких в ацинусах развивается первичный аффект, идущие от него лимфатические сосуды и регионарные лимфоузлы воспаляются, формируется первичный комплекс. В ацинусе возникает гранулема в виде бугорка. Этому способствует накопление в очаге молочной кислоты, низкое значение рН, высокая концентрация углекислого газа. В гранулеме накапливается большое количество лимфоидных, плазматических клеток и фибробластов. В центре гранулемы возникают участки творожистого некроза. Здесь располагаются возбудители, вокруг них эпителиоидные и гигантские клетки. При формировании иммунитета размножение возбудителя замедляется, а потом прекращается, развивается ПЧЗТ. Очаг воспаления затихает, подвергается кальцификации и фиброзу, формируются кальцинаты (очаги Гона). Клинические проявления отсутствуют.

При ослаблении иммунитета снижается чувствительность макрофагов к гамма-интерферону, ослабевает HLA-зависимое представление антигенов, тормозится пролиферация Т-лимфоцитов, активируется система комплемента по альтернативному пути, развивается генерализация инфекционного процесса.

Высокая сенсибилизация организма приводит к токсикоаллергическим реакциям. Клинически этот период сопровождается кашлем, кровохарканьем, снижением массы тела, потливостью, субфебрилитетом.

Улиц с иммунодефицитом наблюдается диссиминированный (милиарный) туберкулез – гранулемы развиваются в различных органах.

Клинические формы туберкулеза:

- очаговый: поражает отдельные органы (чаще в легких, костной системе);

- генерализованные формы: милиарный туберкулез, туберкулезный менингит, туберкулез мочеполовой системы, кишечника и др. органов.

Иммунитет носит нестерильный клеточный характер. Имеют значение Т-лимфоциты, выделяющие медиаторы, усиливающие фаго-

255

цитоз, иммунологическая память. Антитела не ингибируют возбудителя. Развивается инфекционная аллергия ПЧЗТ.

Существует высокая естественная резистентность к возбудителю туберкулеза.

Лабораторная диагностика

Материалом для исследования служат мокрота, моча, ликвор, пунктат лимфоузла, биоптаты тканей.

Бактериоскопический метод. Окрашивают мазки по ЦильНильсену, выявляют мелкие красные палочки. При окраске флюоресцентными красителями (аурамином, родамином) микобактерии дают желто-белое свечение в люминесцентном микроскопе.

При малом количестве возбудителя используют методы обогащения.

Гомогенизация – материал обрабатывают щелочью, фибрин при этом растворяется, а возбудитель высвобождается. Из осадка после центрифугирования готовят мазки.

Флотация – гомогенизированную мокроту обрабатывают ксилолом или бензолом и тщательно встряхивают. Возбудитель всплывает в силу гидрофобности вместе с пеной. Из нее готовят мазок и окрашивают по Цилю-Нильсену.

Бактериологический метод. Материал обрабатывают серной кислотой и засевают на яичные среды.

Таблица

Дифференциация микобактерий

Для идентификации M. tuberculosis проводят оценку свойств возбудителя:

характер роста – обнаруживают сухие, бородавчатые, кремовые колонии (R-форма); длительность роста – 12-60 дней; выявляют наличие корд-фактора (определяют по методу Прайса – на стекло наносят исследуемый материал, обрабатывают серной кислотой для уничтожения кислоточувствительной флоры и погружают препараты в цитратную кровь, через 3-4 дня препараты извлекают, окрашивают по Циль-Нильсену, при микроскопии видны «косы» палочек, при отсутствии корд-фактора возбудитель располагается аморфно); для микобактерий туберкулеза характерен рост только при температуре 37380С; они не растут на простых средах и средах с салицилатами; положительный ниациновый тест (среда с хлорамином В желтеет при накоплении никотиновой кислоты); обладают термолабильной каталазой; восстанавливают нитраты в нитриты; выделяют уреазу; к микобактериям туберкулеза чувствительны морские свинки.

Для внутривидовой дифференциации используют фаготипирование штаммов десятью микобактериофагами.

Для выявления АГ используют ИФА или РИФ, для генной диагностики ставят ПЦР и выявляют генетические маркеры.

Mycobacterium bovis вирулентны в S-форме; колонии кремовые, гладкие; ниациновый тест отрицательный; рост до 40 дней; каталаза термолабильная; выделяют уреазу; не восстанавливают нитраты; рост только при температуре 37-400С.

Mycobacterum africanum – рост 31-40 дней; ниациновый тест положительный; вирулентны в S-форме; каталаза термолабильна; не восстанавливают нитраты; выделяют уреазу. Остальные свойства как у M.tuberculosis.

Микобактерии туберкулеза необходимо дифференцировать от атипичных кислотоустойчивых бактерий, вызывающих микобактериозы.

Атипичные кислотоустойчивые бактерии имеют оранжевый пигмент, вирулентны в S-форме, растут на средах с салицилатами, имеют термостабильную каталазу, рост через 10-20 дней при температуре 22450С, нет корд-фактора.

Кислотоустойчивые сапрофиты M.smegmatis, в отличие от предыдущих возбудителей, растут на простых средах, длительность

257

роста 3-4 дня, имеют S-форму, оранжевый пигмент, нет признаков болезнетворности, чувствительны к спирту.

Биопроба применяется при стертых формах. Морским свинкам внутрикожно втирают исследуемый материал. Через 10-14 дней появляется долго не заживающая язва, и реакция Манту у них становится положительной.

Метод аллергических проб – реакция Манту с туберкулином. Внутрикожно вводят туберкулин PPD (PPD – очищенный белко-

вый дериват). Если организм инфицирован (иммунен), то через 24-48- 72 часа наблюдается инфильтрация и гиперемия, т.е. развивается ПЧЗТ. У больных туберкулезом диаметр папулы на 6 мм (и более) больше, чем у вакцинированных.

Генодиагностика – ПЦР.

Серологический метод: для выявления антител используют РПГА, ИФА.

Профилактика. Неспецифическая профилактика: проводится изоляция и лечение больных до полного прекращения выделения возбудителя. Дезинфекция в очаге 5% фенолом, 1:1000 раствором сулемы, хлорамином, хлорной известью.

Специфическая профилактика проводится живой аттенуиро-

ванной вакциной БЦЖ на 3-5 день после рождения с последующей ревакцинацией при отрицательной реакции Манту.

Вакцина БЦЖ получена Кальметом и Гереном из M.bovis путем многократных посевов на голодные среды, в результате был получен авирулентный штамм, сохранивший высокую иммуногенность.

Лечение проводится антибиотиками и сульфамидными препаратами. Назначают препараты первого ряда – изониазид (тубазид), рифампицин, пиразинамид, стрептомицин, этамбутол. Комбинация из двух препаратов позволяет преодолеть химиорезистентность возбудителя. Альтернативные средства – канамицин, ПАСК, этионамид, циклосирин, капреомицин.

С декабря 1996 г. в Республике Беларусь внедрена в практику усовершенствованная методика химиотерапии больных туберкулезом легких в соответствии с рекомендациями ВОЗ по принципу контролируемой краткосрочной, стантартизованной полихимиотерапии, которая получила межлдународное название как «стратегия DОТs». Эта методика предполагает обязательное использование как правило 4 химиопрепаратов на 1 (начальном) этапе до 2-3 месяцев лечения, а рпи полирезистентности МБТ – до 5-6 препаратов с использованием основных как наиболее активных и эффективных противотуберкулезных средств – изониазида (тубазид), рифампицина, пиразинамида, стрептомицина или этамбутола. На втором этапе (до 2-6 месяцев) продолжение химиотерапии изониазидом и рифампицином в опти-

258

мальных дозах. Проведение химиотерапии осуществляется с учетом чувствительности микобактерий туберкулеза к препаратоам.

Микобактерии лепры (проказы).

Проказа – хроническое инфекционное антропонозное заболевание, источником инфекции которого являются только больные люди. Заболевание носит генерализованный характер и сопровождается поражением кожи, слизистых оболочек, периферических нервов и внутренних органов.

Возбудитель проказы был впервые описан в 1874 г. Ганзеном, а в 1879 г. А. Нейссер предложил способ окраски.

Свойства

Морфологические. Мелкие палочки, реже представляют собой извитые формы, нет спор, капсул, жгутиков, грамположительны. По Циль-Нильсену окрашиваются в красный цвет. Кислотоустойчивы. Строгие внутриклеточные паразиты.

Антигены: О-АГ – соматический, термостабильный, общий с возбудителем туберкулеза. В результате возникает перекрестный иммунитет, который носит клеточный характер, при заболевании снижается число и активность Т-лифоцитов, развивается вторичный иммунодефицит, антитела не выполняют защитной роли.

Культуральные свойства. Не растут на искусственных питательных средах. Могут развиваться в организме броненосцев, корейских бурундуков, в коже лапок белых мышей.

Характеристика заболевания

Единственный источник инфекции – больной человек, который может выделять возбудителя в окружающую среду при кашле, чихании. Инкубационный период 3-5 лет и более.

Основной путь передачи – воздушно-капельный, реже – контактный, трансплацентарный. Остается открытым вопрос о возможности передачи возбудителя кровососущими насекомыми.

Входные ворота – слизистые оболочки и кожа.

Патогенез: возбудитель проникает в кровь, лимфу, нервную систему, внутренние органы. Образуются гранулемы, состоящие из макрофагов, содержащих много микобактерий, т.е. выражен незавершенный фагоцитоз, формируется ПЧЗТ, развивается вторичный иммунодефицит, лимфоциты не подвергаются бласттрансформации, подавляется миграция макрофагов.

Заболевание может протекать в 3-х формах:

- лепроматозная форма – самая тяжелая, наиболее опасна для окружающих. На лице, предплечьях, голенях образуются множественные инфильтраты (лепромы), в них очень много возбудителя. Затем лепромы распадаются, образуются язвы. Поражается кожа, слизистые, лимфатические узлы, нервная система, внутренние органы. При

259

диффузной инфильтрации кожи лица формируется «львиное лицо» – морщины и складки углубляются, нос утолщается, щеки, губы и подбородок приобретают дольчатый вид. На более поздних стадиях выпадают брови, ресницы, развиваются парезы и параличи;

-туберкулоидная – более легкая, менее заразная. Чаще поражается только кожа, появляются симметрично расположенные папулы. Они сопровождаются потерей чувствительности. Возбудителя в очагах меньше;

-недифференцированная – при этом образуются асептические инфильтраты на нижних конечностях, ягодицах. Сначала гиперестезия, затем развивается анестезия. Недифференцированная форма может переходить в I или II форму.

Комитет экспертов ВОЗ по лепре в 1990 г. предложил рабочую классификацию, по которой выделяют многобациллярную лепру (лепроматозную) и малобациллярную лепру (туберкулоидную и недифференцированную).

Без лечения смерть наступает через 5-10 лет от кахексии, иммунодефицита и сопутствующих заболеваний.

Иммунитет. Естественный иммунитет является клеточноопосредованным. Характерен незавершенный фагоцитоз. При лепре развивается вторичный клеточный иммунодефицит. Положительная реакция на лепромин свидетельствует о благоприятном прогнозе.

Лабораторная диагностика

На первый план выступает клиническая диагностика с выявлением изменения чувствительности слизистых верхних дыхательных путей к температурным факторам (от гипостезии до анастезии), образование рубцовых тканей, язв.

Микроскопический метод: исследуют соскоб из гранулем, пунктат из лимфоузлов. Готовят мазки, окрашивают по Циль-Нильсену, выявляют клетки, наполненные возбудителем в виде «пачки сигар». При лепроматозной форме в препарате много плазмоцитов, лимфоцитов, фибробластов. При туберкулоидной форме возбудителя мало, основную массу составляют эпителиальные клетки, вокруг которых располагаются лимфоидные клетки.

Применяют РИФ с люминесцирующими сыворотками для выявления лепрозных антигенов.

Биопробу проводят на бурундуках и броненосцах. Можно вводить материал в кожу лапки белой мыши, развивается инфильтрат, в котором микроскопически выявляют скопления клеток в виде «пачки сигар».

Аллергическая проба носит больше прогностическое, чем диагностическое значение. Вводят внутрикожно лепромин (аллерген), полученный длительным кипячением тканей лепроматозного узла.

260