Глава 6. Криоконсервация сперматозоидов

или экстракцией сперматозоидов из ткани яичка для сохранения фертильности.*

* В этих случаях следует выполнять процедуру, описанную в разделе 6.4.2 на стр. 206.

Высказывалась также озабоченность по поводу того, что в парах с тяжелым мужским фактором бесплодия применение ВРТ со сперматозоидами партнера может быть гораздо менее успешным, чем ВРТ со сперматозоидами донора (397).

6.2.4 Минимизация передачи инфекционных болезней

Для мужчин с ВИЧ-инфекцией, контролируемой антиретровирусной терапией, образцы с невыявляемой вирусной нагрузкой могут быть сохранены для проведения ВМИ, ЭКО или ИКСИ, с тем чтобы их партнерши могли попытаться зачать ребенка при сниженном риске инфицирования ВИЧ. Вирусную нагрузку необходимо также проверять у мужчин, желающих криоконсервировать сперму, которые серопозитивны по гепатиту В или С.

6.3 Оценка риска криоконсервации и хранения эякулята человека

Криоконсервацияипоследующеехранениесперматозоидовчеловекаявляется весьма сложным процессом, который накладывает особую ответственность и потенциальные обязательства на лабораторный персонал. При оценке рисков, связанных с криоконсервацией и хранением эякулята, необходимо рассмотреть нижеследующие вопросы.

6.3.1 Ресурсы

•Физическая безопасность сосудов, образцов и помещения для хранения, необходимая для снижения риска утраты в результате кражи или пожара, повреждения соломин, пробирок и сосудов для криоконсервации и прекращения подачи жидкого азота.

•Пригодность оборудования для предлагаемого использования.

•Система удержания и удаления азота.

•В резервуарах должна быть установлена система оповещения, сигнализирующая об уровне азота ниже определенного порога и о температуре выше определенного порога. Эта система должна быть установлена таким образом, чтобы сигнал поступал до наступления критической ситуации и передавался в центр обработки вызовов, который будет консультировать персонал банка спермы.

199

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

6.3.2 Безопасность и защита персонала

•В банке спермы всегда должны быть в наличии средства индивидуальной защиты. По возможности, в банке спермы должны одновременно находиться два человека; в противном случае персонал, находящийся снаружи, должен быть предупрежден перед входом в банк.

•Рекомендуется устанавливать системы, оповещающие о низких уровнях атмосферного кислорода и связанных с этим корректирующих действиях.

6.3.3 Риск перекрестной контаминации

Для снижения риска перекрестной контаминации инфекционными агентами образцов, находящихся на хранении (например, передача ВИЧ или вирусов гепатита В (HBV) или С (HCV) через сосуд для криоконсервации), рассмотрите следующие вопросы:

•тип контейнера для хранения (пробирки или соломины), метод запечатывания соломин (тепловой или полимерный) и использование вторичного рукава (соломина в соломине);

•среда для хранения: жидкий азот или его пары;

•протокол и метод хранения образцов высокого риска (образцы, которые, как известно или как предполагается, содержат вирусы). В этих случаях рекомендуется, а в некоторых областях требуется использовать отдельные резервуары для положительных образцов в отношении каждого вируса;

•проведениекриоконсервациидлякаждогопациентаотдельноидезинфекция всей поверхности в конце каждой процедуры.

Другие меры предосторожности, которые могут быть приняты для предотвращения или ограничения контаминации, если вышеуказанные меры предосторожности не могут быть обеспечены:

•стерилизация жидкого азота для предотвращения контаминации – целесообразно в случае витрификации, когда образец непосредственно погружается в жидкий азот (398);

•периодическое пополнение сосудов Дьюара или резервуаров стерильным жидким азотом и ежегодная дезинфекция резервуаров для криоконсервации;

•дезинфекция замороженных образцов перед подогревом;

•тестирование всех мужчин при сдаче эякулята на криоконсервацию на следующие вирусы и инфекции, передаваемые половым путем (или в соответствии с национальными правилами):

•ВИЧ, типы 1 и 2 (проведение теста на нуклеиновые кислоты (NAT), который также проверяет наличие антител группы O);

•HBV, включая тест на поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg), тест на общие антитела к коровому антигену вируса гепатита В (анти-HBc) (IgG и IgM) и NAT-тест на HBV или комбинацию, включающую HBV;

200

Глава 6. Криоконсервация сперматозоидов

•HCV, включая тест на антитела к вирусу HCV и NAT-тест на HCV;

•бледная трепонема (т.е. сифилис);

• chlamydia trachomatis (с использованием теста, предназначаемого для выявления инфекции в бессимптомных популяциях с низкой распространенностью);

•гонококковая инфекция (с использованием теста, предназначаемого для выявления инфекции в бессимптомных популяциях с низкой распространенностью);

•Т-лимфотропный вирус человека (HTLV), типы I и II, с использованием теста на анти-HTLV I/II;

•цитомегаловирус (CMV) с использованием теста на анти-CMV (общие и IgG и IgM).

Примечание. Для доноров спермы могут требоваться другие тесты в соответствии с национальным законодательством.

6.3.4 Безопасность замороженных образцов

•Разделите образцы и храните их в отдельных сосудах для криоконсервации и/или в разных местах для снижения риска полной утраты.

•Дважды проверяйте идентичность образцов на каждом этапе.

•Используйте надежную маркировку и идентификационные коды.

•Обеспечьте наличие процедур для регулярного аудита использования материалов и образцов, остающихся на хранении.

•После длительного использования резервуары для криоконсервации могут загрязняться. Поэтому их следует периодически дезинфицировать с помощью растворов, которые не вступают в реакцию с алюминием и сталью. Дезинфекцию рекомендуется проводить не реже одного раза в год.

•Во всех резервуарах должны быть установлены системы оповещения с датчиками пониженных уровней для контроля температуры и уровня жидкого азота. Датчики должны быть подключены к сигнализации для оповещения лабораторного персонала о возможных проблемах.

Источники: (364, 377, 399, 400).

Примечание 1. Хранение в паровой фазе, а не в жидком азоте может способствовать снижению риска перекрестной контаминации. Вместе с тем в сосудах для хранения в паровой фазе могут существовать большие температурные градиенты, зависящие от формы, загрузки и типа контейнеров для образцов. В случае хранения в паровой фазе убедитесь, что оно осуществляется в сосуде, предназначенном для этой цели и ратифицированном в соответствии с международными стандартами медицинского оборудования.

201

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

Примечание 2. Для хранения в жидком азоте доступны безопасные соломины из термосвариваемой иономерной смолы (соломины повышенной безопасности). Они защищены от протечек, бактерий и вирусов и механически устойчивы при температуре –96°C (364, 377, 400).

6.4 Протоколы криоконсервации эякулята

Существует несколько протоколов замораживания и управления банками спермы (377). В продаже имеется несколько криопротекторов. Криопротекторы подразделяются на проникающие (среди которых наиболее широко используется глицерин) и непроникающие (например, молекулы сахара и яичный желток). Можно использовать криопротекторы, содержащие или не содержащие яичный желток (в качестве разбавителей эякулята) (377). Ниже приведена подробная информация о широко используемом криопротекторе (глицерин-яичный желток-цитрат (GEYC)) и процедурах программируемого или парового замораживания.

С учетом того, что криоконсервированные сперматозоиды могут быть использованы для получения эмбрионов, все процедуры должны, по возможности, проводиться под вытяжкой класса А в классифицированном помещении (не ниже D) в соответствии с международными рекомендациями по надлежащей производственной практике. Методы и условия замораживания, не соответствующие этому стандарту, должны быть задокументированы, но, если они законны, это не является основанием для отказа в осуществлении хранения.

6.4.1 Стандартная процедура

6.4.1.1 Приготовление криопротектора GEYC

Примечание. Криопротекторы могут быть приготовлены в лаборатории, но следует отметить, что эффективность раствора и его безопасность невозможно полностью контролировать.

Обычно предполагается, что при наличии возможности используются криопротекторы, изготовленные на коммерческой основе, сертифицированные и одобренные для использования в терапевтических целях. Это особенно актуально для криопротекторов на основе яичного желтка в связи с возможным присутствием загрязняющих веществ из корма для кур или окружающей среды. Описанные ниже процедуры весьма сложно стандартизировать до уровня, необходимого для терапевтического использования ВРТ в местных лабораториях.

Приготовление GEYC:

1.К 65 мл стерильной очищенной воды добавьте 1,5 г глюкозы и 1,3 г трехосновного дигидрата цитрата натрия.

2.Добавьте 15 мл глицерина и тщательно перемешайте.

202

Глава 6. Криоконсервация сперматозоидов

3.Добавьте 1,3 г глицина. После того, как он растворится, пропустите раствор через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

4.Добавьте 20 мл свежего яичного желтка (полученного предпочтительно из особых яиц, не содержащих патогенов). Для этого вымойте яйцо и удалите скорлупу. Проколите оболочку вокруг желтка и наберите содержимое в шприц (из одного яйца будет получено примерно 10 мл желтка).

5.Поместите всю суспензию на водяную баню при 56°C на 40 минут, периодически перемешивая вихревым способом.

6.Проверьте рН раствора. Если он находится вне диапазона 6,8–7,2 из-за добавления неправильных ингредиентов или неправильных количеств ингредиентов, удалите раствор и приготовьте новый.

7.На этой стадии может быть выполнен бактериологический посев для тестирования стерильности.

8.На этой стадии может быть также проведено тестирование на токсичность сперматозоидов.

9.Распределите раствор по аликвотам объемом 2 мл в стерильных условиях и храните при –70°C.

10.Используйте в течение 3 месяцев.

Криопротектороы, аналогичные GEYC, коммерчески доступны.

6.4.1.2 Добавление криопротектора в эякулят

1.Разморозьте криопротектор при комнатной температуре и перемешайте. Может быть целесообразным первоначальное размораживание при 37°C.

2.Высокая концентрация глицерина разрушительна для сперматозоидов. Поэтому важно проявлять особую осторожность при добавлении криопротектора и его перемешивании с эякулятом.

3.Добавьте один объём криопротектора GEYC к двум объемам эякулята либо капля за каплей с вихревым перемешиванием, либо аккуратным пипетированием, перемещая пипетку вверх и вниз, либо постепенно, добавляя раствор пять раз и аккуратно перемешивая в течение примерно 10 минут при комнатной температуре.

4.После добавления криопротектора GEYC в полном объеме инкубируйте смесь при 30–35°C в течение 5 минут.

6.4.1.3 Заполнение соломин эякулятом

1.Пластиковые соломины объемом 0,5 мл широко используются благодаря своим теплопроводным свойствам и простоте хранения. Для хранения больших объемов можно использовать пластиковые пробирки.

203

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

2.АспирируйтесмесьэякулятаикриопротектораGEYCвпластиковыесоломины для эякулята объемом 0,5 мл или поместите ее в криопробирки. Некоторые коммерческие соломины снабжены одноразовым «наполнительным наконечником», который позволяет избежать прямого загрязнения конца соломины эякулятом. Соломины можно заполнять с помощью специального вакуумного устройства или адаптера, надеваемого на их конец. Соломины наполняются до тех пор, пока жидкость не коснется ватной пробки, которая предотвращает опорожнение соломины при прекращении аспирации.

6.4.1.4 Запечатывание соломин с эякулятом

1.Оставьте воздушное пространство в 1 см в нижнем конце, постучав по боковой поверхности контейнера. При использовании наполнительного наконечника это будет сделано автоматически.

2.Запечатайте соломины с обоих концов с помощью аппарата для термосварки.

3.Вытрите насухо внешнюю поверхность контейнера, а затем простерилизуйте его 70%-ным (v/v) спиртом или другим дезинфицирующим средством.

4.Убедитесь, что соломины маркированы правильными данными о пациенте/ доноре и что они правильно запечатаны с обоих концов, на этой стадии или ранее (раздел 6.4.3 на стр. 207).

6.4.1.5 Охлаждение и замораживание эякулята в программируемых морозильных камерах

Существуют программируемые морозильные камеры, которые контролируют подачу паров жидкого азота в морозильную камеру.

1.Поместитесоломиныиликриопробиркивпрограммируемыйзамораживатель и выполните инструкции производителя для активации программы.

2.Общая программа предусматривает охлаждение соломин на 1,5°C в минуту с 20°C до –6°C и затем на 6°C в минуту до –100°C. На это уходит примерно 40 минут. Затем в течение 30 минут температура в камере будет автоматически поддерживаться на уровне –100°C на случай задержки в переносе соломин в жидкий азот.

3.В зависимости от опыта работы в отдельных лабораториях могут использоваться другие, более сложные, процедуры (401).

6.4.1.6 Охлаждение и замораживание эякулята ручным методом

Ручные методы в меньшей мере управляемы и стандартизированы, чем метод программируемого замораживания, но они также обеспечивают приемлемые результаты. У этой процедуры есть целый ряд альтернативных вариантов.

1. Поместите соломины в морозильную камеру холодильника (–20°C) на 30 минут, а затем на сухой лед (–79°C) на 30 минут, после чего поместите их в жидкий азот (–196°C).

204

Глава 6. Криоконсервация сперматозоидов

2.Соломины могут быть перенесены из морозильной камеры с температурой –20°C в другую морозильную камеру с температурой –70°C или в сосуд со смесью паров жидкого азота и воздуха, размещенный в узкой части небольшого контейнера с жидким азотом, при температуре от –80°C до –100°C на 10–15 минут, после чего они могут быть помещены в жидкий азот. Их можно также поместить на штатив, установленный на высоте 10–20 см над жидким азотом в большом контейнере, и оставить на 1 час для создания температурного градиента над жидким азотом.

6.4.1.7 Быстрое замораживание в парах

Быстрое замораживание в парах ручным методом может также дать приемлемые результаты.

1.Поместите соломины в пары жидкого азота на высоте около 10 см над уровнем N2 (при –80°C) на 8–10 минут, чтобы обеспечить начальное медленное замораживание. Для стандартизации процесса можно использовать имеющиеся в продаже боксы с плавающими штативами для соломин или криопробирок, которые поддерживают фиксированное расстояние между соломинами и азотом.

2.Сразу после этого погрузите соломины в жидкий азот.

6.4.1.8 Хранение замороженного эякулята

1.Поместите замороженные соломины в пластиковые пробирки для хранения (например минибокалы, пробирки на подпорках или контейнеры для соломин) и вставьте их в более крупные бокалы для хранения.

2.Храните бокалы с соломинами в вакуумных сосудах (Дьюара) или резервуарах с жидким азотом.

6.4.1.9 Транспортировка замороженного эякулята

Замороженные сперматозоиды можно перевозить в имеющихся в продаже сухих контейнерах, охлаждаемых жидким азотом. Достаточно низкие температуры могут поддерживаться за счет испарения жидкого азота от нескольких дней до нескольких недель, в зависимости от размера контейнера.

Примечание. Необходимо обеспечить соблюдение местных, национальных и международных правил транспортировки жидкого азота и биологических образцов человека.

6.4.1.10 Размораживание замороженного эякулята

1.Перед использованием извлеките необходимое количество соломин или криопробирок из резервуара с жидким азотом или паром и незамедлительно поместите их в тепло при температуре 37°C (в инкубатор, а еще лучше в блок сухого тепла для контактного нагрева, который можно легко дезинфицировать между использованиями).

205

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

2.После полного размораживания отрежьте конец соломины стерильными ножницами и загрузите содержимое в устройство для инсеминации (для терапевтического использования) или выпустите содержимое для определения подвижности после размораживания (для проверки процесса замораживания).

3.Удалите криопротектор, добавив культуральную среду перед центрифугированием в течение 10 минут при 500g. Удалите супернатант и разведите осадок сперматозоидов в культуральной среде до надлежащего объема (402).

В случае, если пациенты решат избавиться от своего криоконсервированного эякулята, соломины и/или криопробирки должны быть извлечены и удалены в отходы в присутствии свидетеля, который может подтвердить, что это правильный материал.

6.4.2 Модифицированные протоколы замораживания образцов с олигозооспермией и хирургически извлеченных сперматозоидов

Эякулят, содержащий лишь несколько подвижных сперматозоидов, и суспензии сперматозоидов, полученные из половых путей или в результате биопсии яичка, можно хранить для последующей ИКСИ.

•Если необходимо криоконсервировать совсем малое количество сперматозоидов, требуются индивидуальные стратегии в зависимости от образца.

•В продаже имеются специальные устройства для криоконсервации даже одного сперматозоида, хотя для многих из таких устройств требуются микроманипуляции (403). Такие устройства затем помещают в криопробирки и хранят в жидком азоте в соответствии с рекомендациями производителя.

•При отсутствии таких устройств рекомендуется стратегия замораживания в минимальном объеме.

•Аспирированные из ткани яичка или придатка яичка жидкости, содержащие сперматозоиды, и суспензии сперматозоидов, отобранных методом всплытия или ЦГП из цельной спермы (раздел 5.4 на стр. 187 и раздел 5.5 на стр. 188) и ресуспендированных в среде для приготовления эякулята, забуференной HEPES и HSA (4 мг/мл), могут быть подвергнуты криоконсервации с помощью криопротектора Тироде, содержащего глюкозу и глицерин (TGG), или коммерческого криопротектора в соответствии с инструкциями производителя.

•Для замораживания неповрежденной ткани яичка с целью получения сперматозоидов для дальнейшего использования требуются специально разработанные протоколы.

206

Глава 6. Криоконсервация сперматозоидов

6.4.2.1 Модифицированный криопротектор (TGG)

1.К 40 мл стерильного раствора Тироде добавьте 5 мл стерильного исходного раствора сывороточного альбумина человека (100 мг/мл), 0,9 г глюкозы и 5 мл глицерина. Пропустите раствор через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

2.Храните в аликвотах объемом 2 мл при –70°.

О приготовлении криопротектора в лабораторных условиях см. примечание в

разделе 6.4.1.1 на стр. 202.

6.4.2.2 Процедура

1.Если объем образца превышает 2,0 мл, а подвижных сперматозоидов мало, центрифугируйте его при 1 500g в течение 5 минут при комнатной температуре.

2.Аспирируйте супернатант, с тем чтобы оставить около 1,0 мл, и ресуспендируйте в нем сперматозоиды. Определите процентную долю подвижных сперматозоидов (PR+NP); при крайне малом количестве подвижных сперматозоидов, оцените число подвижных клеток под каждым покровным стеклом.

3.Разморозьте аликвоту TGG или тест-желточного буфера (TYB) объемом 2 мл.

4.Постепенно добавьте один объем TGG или TYB к одному объему конечного препарата эякулята, периодически перемешивая.

5.Поместите препарат в соломины или криопробирки и заморозьте, как указано выше. Если соломины не заполнены полностью, накройте минибокал крышкой, с тем чтобы предотвратить всплытие соломин при замораживании.

6.4.3 Маркировка соломин/криопробирок и ведение записей

Для маркировки соломин или пробирок необходима надежная система кодирования. Используйте коды во всех лабораторных записях и компьютерных базах данных для сохранения анонимности доноров. Храните ключ к коду с идентификационными данными донора отдельно и в надежном месте. Существует множество возможных систем кодирования; важным требованием является наличие уникального кода для каждого донора или клиента. В случае клиентов/пациентов важно идентифицировать каждую соломину/криопробирку путем указания имени, фамилии, даты рождения, номера больницы, даты криоконсервации и любых других данных, требуемых в соответствии с национальным законодательством. Следующая система кодирования отвечает необходимым условиям:

•Каждому новому анонимному донору присваивается двухбуквенный код (AA, AB, AC, … , BA, BB и т.д. до ZZ, после чего необходимо использовать новый метод).

•Для пациентов и известных доноров используется система трехбуквенных кодов: AAA, AAB и т.д.

207