Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

6.Инкубируйте суспензии сперматозоидов в течение 3 часов при 37°C и 5%-ной

концентрации (v/v) CO2, с тем чтобы вызвать капацитацию (ослабьте крышку пробирки, чтобы обеспечить газообмен). Если CO2-инкубатор недоступен, используйте среду, забуференную HEPES (раздел 8.4 на стр. 263), плотно укупорьте пробирки и инкубируйте при 37°C.

7.Добавьте 10 мкл исходного раствора A23187 (1 ммоль/л) в пробирки с тестируемыми препаратами для получения конечной концентрации 10 мкмоль/л.

8.Добавьте 10 мкл ДМСО в пробирку с контрольным образцом.

9.Инкубируйте все пробирки при 37°C в течение 15 минут.

10.Отберите небольшие аликвоты из каждой пробирки для определения подвижности сперматозоидов.

11.Выполните следующие шаги в соответствии с разделом об обработке эякулята (раздел 4.2.2.4 на стр. 164).

Выполните процедуры (разделы 4.2.2.5 и 4.2.2.6), оценку (раздел 4.2.2.7) и подсчет (раздел 4.2.2.8), как описано выше на стр. 164–166.

4.2.3.3 Контроль качества

•При проведении этого исследования необходимо каждый раз использовать образец для положительного контроля (эякулят мужчины, сперматозоиды которого ранее хорошо реагировали на ионофор или прогестерон).

•Каждый раз, когда готовится новая партия красителя, проводите перекрестный тест со старым красителем, используя сперматозоиды из образца для положительного контроля с известной реакцией, с тем чтобы убедиться, что краситель приготовлен правильно.

4.3 Оценка хроматина сперматозоидов

4.3.1 Справочная информация

Стабильность структуры хроматина сперматозоидов имеет фундаментальное значение для развития и качества эмбриона, по всей вероятности, благодаря защите и быстрой доступности отцовского генома (300). Нарушение стабильности хроматина сперматозоидов связано с более низким уровнем оплодотворения при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (301). Аномалии в структуре хроматина сперматозоидов могут вызывать повреждения ДНК сперматозоидов, такие как двойные или одиночные разрывы нитей ДНК, из-за неправильной компактизации ДНК (т.е. аномалии, связанныесзамещениемгистоновпротаминами).Нормальныйстатусхроматина сперматозоидов может быть оценен либо путем оценки разрывов нитей ДНК (раздел 3.2 на стр. 97), либо с помощью красителей, которые связываются с гистонами (анилиновый синий) или нуклеиновой кислотой (хромомицин A3) и оцениваются гистологически или с помощью проточной цитометрии.

168

Глава 4. Углубленные исследования

4.3.2 Оценка с использованием анилинового синего

Анилиновый синий (АС) связывается с остатками лизина гистонов. Процентная доля сперматозоидов, окрашенных АС, может быть оценена как в цельной сперме, так и в отобранных (методом всплытия или путем центрифугирования в градиенте плотности (см. раздел 5.5 на стр. 188) сперматозоидах.

4.3.2.1 Протокол

Реагенты

•Порошок АС растворяют в воде, содержащей 4%-ную ледяную уксусную кислоту (pH 3,5), при конечной концентрации 5%.

Процедура 1. Возьмите 1×106 сперматозоидов (если нет 1 миллиона, не менее

200 000 сперматозоидов).

2.В случае цельной спермы отмойте сперматозоиды дважды в любой культуральной среде для сперматозоидов (раздел 5.3 на стр. 186) (центрифугируйте при 500g в течение 5 минут при комнатной температуре). В случае отобранных сперматозоидов, центрифугируйте один раз при 500g в течение 5 минут.

3.Удалите супернатант и фиксируйте осадок в 50 мкл 4%-ного параформальдегида (конечная концентрация 200 000 сперматозоидов/10 мкл) в течение 30 минут при комнатной температуре.

4.Поместите каплю образца объемом 10 мкл на предметное стекло и высушите на воздухе.

5.Погрузите предметное стекло в раствор АС на 7 минут при комнатной температуре.

6.Промойте предметное стекло дважды в воде, чтобы удалить излишки красителя.

7.Высушите предметное стекло на воздухе.

8.Оцените под оптическим микроскопом с масляной иммерсией (объектив ×100 и окулярное увеличение ×10–12,5). Должно быть оценено не менее 200 сперматозоидов.

169

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

Рис. 4.2 Пример АС-положительных (a) и АС-отрицательных (b) сперматозоидов под оптическим микроскопом (×1000, масляная иммерсия)

Из документа Марчиани и др. (302)

4.3.2.2 Проблемы

•В некоторых случаях оценка может быть затруднена. В частности, трудности могут возникнуть в случае агглютинации сперматозоидов.

•Оценка зависит от опыта лаборанта.

4.3.3 Оценка с использованием хромомицина A3

Хромомицин A3 (CMA3) конкурирует с протаминами за связывание с малой бороздкой спирали ДНК. Процентная доля сперматозоидов, окрашенных CMA3, может быть оценена либо в цельной сперме, либо в сперматозоидах, отобранных методом всплытия.

4.3.3.1 Протокол

Реагенты

1. Приготовьте исходный раствор CMA3:

•приготовьте буферный раствор Мак-Илвейна (20 мл, должен храниться при комнатной температуре):

170

Глава 4. Углубленные исследования

•добавьте 16,47 мл раствора Na2HPO4 0,2 М и 3,53 мл раствора лимонной кислоты 0,1 М10;

•добавьте MgCl2 для достижения конечной концентрации 10 мМ. pH должен быть 7,0;

•растворите 5 мг порошка CMA3 в 10 мл буферного раствора Мак-Ильвейна, чтобы получить 2× исходный раствор. Аликвоты исходного раствора CMA3 можно хранить при температуре –20°C.

2.В момент использования разведите аликвоты эякулята 1 : 1 в буферном растворе Мак-Ильвейна для получения конечной концентрации CMA3 0,25 мг/мл.

Процедура 1. Возьмите 1×106 сперматозоидов (если нет 1 миллиона, не менее

400 000 сперматозоидов).

•В случае цельной спермы отмойте сперматозоиды дважды в любой культуральной среде для сперматозоидов (раздел 5.3 на стр. 186) и центрифугируйте при 500g в течение 5 минут при комнатной температуре.

•В случае отобранных сперматозоидов центрифугируйте один раз при 500g в течение 5 минут.

2.Удалитесупернатантификсируйтеосадокв50мкл4%-ногопараформальдегида (конечная концентрация 400 000 сперматозоидов/10 мкл) в течение 30 минут при комнатной температуре.

3.Отберите аликвоту объемом 10 мкл и центрифугируйте при 300g в течение 7 минут при комнатной температуре.

4.Удалите супернатант и промойте один раз в DPBS путем центрифугирования при 300g в течение 7 минут при комнатной температуре.

5.Удалите супернатант, добавьте 100 мкл раствора СМА3 (0,25 мг/мл) и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.

6.Добавьте 200 мкл буферного раствора Мак-Илвейна и центрифугируйте при 300g в течение 7 минут при комнатной температуре.

7.Удалите супернатант, ресуспендируйте осадок в 10 мкл буферного раствора Мак-Ильвейна и поместите его на предметное стекло.

8.Высушите каплю на воздухе, добавьте каплю DPBS и поместите на нее покровное стекло.

9.Считывайте под флуоресцентным микроскопом с увеличением 1000× (с масляной иммерсией) (длина волны возбуждающего излучения 445 нм, длина волны эмиссионного излучения 575 нм). Должно быть подсчитано не менее 200 сперматозоидов.

171

Лабораторное руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека, шестое издание

Рис. 4.3 Примеры CMA3-положительных (a) и CMA3-отрицательных (b) сперматозоидов (левая панель)

Светлое поле

На правой панели (светлое поле) можно увидеть СМА3-отрицательные сперматозоиды в том же поле. Адаптировано из документа Марчиани и др. (303).

4.3.3.2 Проблемы

•В некоторых случаях оценка может быть затруднена. В частности, трудности могут возникнуть в случае агглютинации сперматозоидов или из-за флуоресцентного фона.

•Оценка зависит от опыта лаборанта.

172