3 курс / Общая хирургия и оперативная хирургия / Мельцова_А_Ж_Использование_аллогенных_фибробластов_в_комплексном

61

В случаях ТЯ средней и большой площади (более 12 см2) пересадка ДЭ на язвенный дефект проводилась неоднократно, в соответствии с описанной методикой.

2.5. Статистическая обработка полученных результатов.

Обработка полученных результатов производилась методом вариационной статистики с расчетом среднего арифметического значения (М), ошибки средней арифметической (m), уровня достоверности (р). О достоверности различий между рядами значений судили по t – критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при р < 0,05. Создание базы данных, их статистическая обработка, графическое оформление и правка текста производилась с помощью программ Microsoft Excel, Microsoft Access и Microsoft Word для Windows XP на IBM PS.

62

Глава III. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЕРМАЛЬНОГО ЭКВИВАЛЕНТА В ЛЕЧЕНИИ КОЖНОЙ РАНЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

Анализируя результаты выполненной экспериментальной части работы, необходимо отметить, что любая выбранная у животных модель экспериментальной раны не отражает сложный комплекс процессов, происходящих у больных в ТЯ венозной этиологии. К сожалению, до настоящего времени не предложена, да и представляется сомнительным, возможность моделирования в эксперименте венозных ТЯ на животных (Глянцев С.П., 2002). Поэтому анализ полученных в эксперименте результатов проводился с позиции нормального течения раневого процесса, за исключением двух факторов. Во первых, ограничивающее кольцо препятствовало развитию контракции раны. Концентрическое стягивание краев раны, при нормальном течении раневого процесса, позволяет существенно сократить размеры кожного дефекта на подвижных участках кожи до 90% (Ефимов Е.А., 1984, Саркисова Д.С.,1987). Отсутствие контракции определяло большой размер раневого дефекта, в результате заживление проходило вторичным натяжением, т.е. через формирование ГТ. Вторым отличием являлось отсутствие краевой эпителизации, также за счет полихлорвинилового кольца. В связи с этим процесс эпителизации оценивался по разрастанию эпидермиса из кожного аутологичного трансплантата. Приживление аутодермотрансплантата отмечено у всех животных основной и контрольной групп. Развития гнойного воспаления не было отмечено ни в одном случае.

По результатам проведенных экспериментов выполнена оценка влияния аллогенных клеток на течение раневого процесса в экспериментальной ране с помощью биохимического анализа ГТ и гистологического анализа биоптатов заживающей раны.

Новообразованная ГТ экпериментальной раны — этот тот субстрат, в котором в первую очередь ожидались изменения после пересадки аллогенных фибробластов. Поэтому для оценки процессов синтеза в ГТ выполнялся

63

биохимический анализ содержания в ней нуклеиновых кислот и аминокислот в ранах животных основной и контрольной групп.

Одним из показателей, характеризующих синтетические процессы в тканях, является содержание в ней нуклеиновых кислот и соотношение между РНК и ДНК. Проведенный анализ позволил сделать вывод, что аппликация дермального эквивалента приводит к выраженной стимуляции синтетических процессов в ткани (табл. 7). При этом существенно возрастает количество РНК и изменяется отношение РНК/ДНК.

Таблица 7. Сравнительное содержание ДНК и РНК в грануляционной ткани экспериментальных ран животных основной и контрольной групп.

Другим показателем, характеризующим состояние процессов синтеза, является содержание в ней аминокислот. До недавнего времени анализу аминокислотного состава тканей уделялось относительно мало внимания, однако проведенные при ожоговой травме исследования показали большую диагностическую ценность этого метода. В частности, известно, что гипераминоацидемия развивается уже на 3-6-е сутки после ожога, после чего постепенно начинает уменьшаться. Повышение уровня свободных аминокислот в тканях часто свидетельствует о процессах внутриклеточного протеолиза. Наоборот, уменьшение содержания свободных аминокислот может свидетельствовать о включении их в интенсивно происходящие процессы

65

На основании полученных данных о биологических свойствах препарата было сделано заключение о том, что аппликация дермального эквивалента на рану приводит к активации биосинтетических процессов в грануляционной ткани животных основной группы.

Дальнейшие результаты основаны на морфологическом анализе биоптатов экспериментальных ран. Обязательными объектами, присутствующими на срезе, являлись краевая зона дермального аутотрансплантата с зоной новообразованного эпителия и прилежащий участок ГТ.

Учитывая, что формирование и созревание ГТ является одним из основных звеньев процесса заживления кожных ран, а также то, что именно фибробласты играют ключевую роль в этом процессе, было выполнено морфометрическое исследование структуры ГТ. Исследованию подвергали ГТ, полученную на 6-е и 9-е сутки.

В каждом препарате морфометрия производилась в 5 полях зрения. В каждом поле зрения проводили подсчет лимфоцитов, лейкоцитов, плазматических клеток, макрофагов, фибробластов и кровеносных сосудов. По данным морфометрии были построены вариационные ряды. Результаты проведенных исследований приведены в табл. 9 и 10.

66

Таблица 9. Количественный состав грануляционной ткани, 6-е сутки

67

Таблица 10. Количественный состав грануляционной ткани, 9-е сутки

Как видно из табл. 9 и 10, применение коллагенового геля с живыми фибробластами обусловило существенное изменение клеточного состава ГТ. В

68

частности, более интенсивно происходит ангиогенез и образование новой соединительной ткани. Анализ цитограмм показал, что пересадка клеточной культуры в коллагеновом геле привела к следующим изменениям в составе ГТ (по сравнению с контролем). В грануляционной ткани животных опытной группы были менее выражены явления воспаления, о чем свидетельствует меньшее количество лейкоцитов и макрофагов. Помимо этого, более активно протекают репаративные процессы, о чем свидетельствуют следующие показатели: большее количество фибробластов и кровеносных сосудов по сравнению с контрольной группой.

Анализируя результаты морфометрического анализа соединительной ткани, необходимо заметить, что мы не увидели каких-либо новых, отличных от описанных в литературе признаков заживления не в опытной, ни в контрольной группах. Течение раневого процесса соответствовало фазам, неоднократно описанным и исследованным. В первые сутки после нанесения раны развивается первая фаза — фаза травматического воспаления, к морфологическим признакам которой относятся гиперемия сосудов, усиленная серозно-фиброзная экссудация, нейтрофильная инфильтрация, сменяющаяся макрофагальной реакцией (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981). Исследование этой фазы не входило в задачи исследования, поэтому на ранних сроках исследования не проводились. На смену первой фазе приходит фаза развития ГТ, начинается она с 4-6 суток и характеризуется именно тем, что фибробласты становятся преобладающими клеточными элементами (Серов В.В., Шехтер А.Б., 1981). Таким образом, по результатам анализа количественного состава ГТ в обеих группах структура ГТ на 6-е сутки соответствует по морфологическим признакам смены фазы воспаления на вторую фазу. В это время наблюдается более раннее уменьшение признаков воспаления (меньшее количество лимфоцитов и макрофагов) и более выраженные явления, характерные для второй фазы (большее количество фибробластов и кровеносных сосудов), в ГТ ран животных основной группы по сравнению с контрольной. Вышеизложенное позволяет говорить, что пересаженные

69

аллогенные ФБ сохраняют свою функциональную активность и включаются в процесс заживления раны реципиента. Выполняя свойственные им функции по синтезу экстрацеллюлярного матрикса и выделению биологически активных веществ, в комплексе с коллагеном ФБ ускоряют смены фаз раневого процесса. К 9-м суткам отмечается прогрессирование этих изменений в основной группе.

Таким образом, аллогенные дермальные ФБ не изменяют основные направления формирования ГТ, однако трансплантация функционально активных фибробластов и коллагена ускоряют эти процессы.

Формирование ГТ является важной и во многом предопределяющей, однако процесс формирования эпителия представляет наибольший интерес, т.к. именно он формирует заживление кожного дефекта.

Гистологические исследования биоптатов выявили, что структура формирующегося неоэпидермиса была обусловлена закономерной эволюцией процессов пролиферирации и дифференцировки клеток покровного эпителия. Пролиферация кератиноцитов отмечалась уже в первые сутки после травмы, к 9-14-м суткам разрастание эпителиальной ткани было весьма значительным.

Морфологическое строение кожи кожного аутотрансплантата визуально не отличалось от нормального строения кожи крысы. В участках, где восстановление кожи происходило преимущественно за счет краевой эпителизации, граница между эпидермисом и подлежащей тканью была представлена прямой линией.

Гистоморфометрическое исследование выявило, что увеличение толщины неоэпидермиса происходит в динамике за счет расширения его отдельных слоев. Соотношение базально-шиповатого слоя к зернисто-роговому составляло 2-3:1 (в норме — меньше), что указывает на относительное преобладание процессов пролиферации клеток базально-шиповатого слоя над терминальной дифференцировкой в последующих слоях неоэпидермиса. К 14 суткам наблюдения эти два процесса закономерно уравновешивались, показатель составлял 1:1. Так, если в норме соотношение рогового слоя к зернистому составляет 1:0,4, то при распространении эпителия из

70

аутодермотрансплантата к 14-е суткам этот показатель составляет 1:1. Этот факт можно объяснить снижением пролиферативной активности клеток базального слоя или, что более вероятно, повышенным слущиванием роговых чешуек с поверхности неоэпидермиса, причиной чего является его прямой контакт с окружающей средой. Слущивание рогового слоя по механизму обратной связи должно приводить к стимуляции процессов пролиферации и укорочению цикла терминальной дифференцировки кератиноцитов, то есть повышению скорости самообновления клеток эпидермиса. По-видимому, данный механизм и обуславливает гиперплазию неоэпидермиса, что подтверждается повышенной митотической активностью клеток базального слоя.

Атипичных врастаний в подлежащую дерму не отмечено. Базальная пластинка была сформирована, что свидетельствует о наличии трофического взаимодействия неоэпидермиса и дермы и о прочности эпидермальнодермального соединения.

Итак, структура аутодермотрансплантатов практически не отличалась от таковой интактной кожи крысы. Все слои эпидермиса сформированы одинаково хорошо. Единственным отличием является несколько меньшая толщина дермы по сравнению с интактной кожей. Кроме того, было выявлено, что местами дерма в аутодермотрансплантатах более тонкая.

В ходе эксперимента перед пересадкой мы ножницами удаляли фасцию с дермальной стороны кожи. Именно такая механическая обработка обусловила различия в толщине дермы трансплантата в разных ее участках. Граница между прижившимся аутодеомотрансплантатом и подлежащей тканью видна по изменению интенсивности окраски, что связано с различным содержанием коллагена в новообразованной ГТ и вполне сформированной дермой в кожном трансплантате. Указанная картина была отмечена во всех наблюдениях (в основной и контрольной группах животных) и в различные сроки после операции.